Colorazione con perossisoma nelle cellule di mammiferi utilizzando sonde specifiche per perossisomi

Quindi la nostra ricerca si concentra sulla comprensione dei perossisome, che sono organelli essenziali per il metabolismo dei lipidi e l'equilibrio ossidativo cellulare. Il nostro obiettivo è scoprire come la loro struttura e funzione siano regolate e come questi processi cambino nelle malattie. Per raggiungere questo obiettivo, sviluppiamo sonde fluorescenti che permettono a noi e alla comunità scientifica più ampia di visualizzare i perossisomi in una gamma di cellule animali.

Qui sviluppiamo protocolli di colorazione che funzionano sia in cellule vive che fisse, fornendo strumenti potenti per studiare la biologia della paroxetina in ambito sanitario e patologico. Una delle principali sfide sperimentali è ottenere la marcatura non invasiva dei perossisomi nelle cellule animali. Sebbene la colorazione degli anticorpi aiuti a superare questo problema, manca la presenza di anticorpi commercialmente disponibili per le proteine parossische.

Un'altra sfida è visualizzare i perossisomi in modo non invasivo in tempo reale, il che richiede protocolli adattabili. Infine, la colorazione convenzionale non fornisce una lettura funzionale. Mentre la colorazione basata sulla perossidasi può variare a seconda della funzione parossistica, che rappresenta sia una sfida che un'opportunità, perché ci permette di distinguere gli stati funzionali parossisici all'interno della cellula.

Inizia con cellule di mammiferi seminate il giorno prima in un piatto con coperture che ora sono a una confluenza del 30-70%. Diluire la sonda del perossisoma con un substrato fresco in un tubo microcentrifugato sensibile alla luce per ottenere una concentrazione finale di quattro micromolari. Seleziona il pozzo desiderato da tingere e etichetta l'esterno usando una penna pennarella.

Aspirare 0,5 millilitri di materiale dal pozzo selezionato e sostituirlo con il materiale di sonda preparato, goccia dopo goccia lungo la parete del pozzo. Dopo la dispensazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Da questo momento in poi, proteggi le cellule dalla luce usando carta stagnola.

Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il materiale macchiato e lavare le cellule due volte con PBS. Poi, posiziona la piastra sotto un cappuccio chimico, aggiungi il 4% di paraformaldeide in PBS alle cellule e incuba a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo la fissazione, rimuovi il paraformaldeide in un contenitore designato per i rifiuti e lava le cellule una volta con PBS.

Successivamente, aggiungere lo 0,5% di Triton X in PBS per permeabilizzare le cellule e incubare per 2,5 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il Triton X e lavare le cellule due volte con PBS per 10 minuti ciascuna. Per bloccare le cellule, incubarle con albumina sieroica al 5% in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius.

Esegui la procedura di colorazione immunofluorescente seguendo il protocollo standard. Infine, esegui una microscopia per acquisire immagini sia di cellule fisse che di celle vive. La colorazione delle cellule vive con sonde Peroxi_SPY ha portato all'importazione dipendente dalla sottofamiglia D della cassette legata all'ATP nei perossisome, generando un alto rapporto di fluorescenza perossisoma/citoplasma nelle cellule metabolicamente attive.

Nelle cellule HEK-293T di tipo selvatico che esprimono GFP-SKL, la colorazione Peroxi_SPY555 mostrava una classificazione distinta con i perossisome, mentre nelle cellule knockout PEX19 prive di perossisome, la colorazione era assente. Nei fibroblasti umani, Peroxi_SPY colorazione colocalizzata con il marcatore parossistico GFP-SKL, confermando il targeting perossisomico. La quantificazione della densità dei perossisomi ha rivelato una variazione significativa tra i diversi tipi cellulari.

Le condizioni di colorazione ottimizzate nelle cellule COS-7 utilizzando 250 nanomolari Peroxi_SPY per 20 minuti hanno aumentato significativamente il rapporto di fluorescenza perossisoma a citoplasma rispetto al protocollo originale di un micromolare per 10 minuti. L'incubazione prolungata delle cellule HEK-293T con Peroxi_SPY per 24 ore ha portato a un miglioramento del rapporto di intensità di fluorescenza perossisoma/citoplasma rispetto a 15 minuti, nonostante la colorazione con perossisoma ridotta. Un protocollo di fissazione ha permesso il risuccesso del costaining degli anticorpi, dimostrato grazie al marcatore Peroxi_SPY preservato e all'immunocolorazione Anti-PEX14 nelle cellule HuH-7 e HEK-293T.

La quantificazione ha mostrato che le procedure di fissazione e permeabilizzazione influenzavano l'intensità della fluorescenza del perossisoma rispetto alla colorazione delle cellule vive. Abbiamo sviluppato il colorante Peroxi_SPY che può essere utilizzato per visualizzare i perossisomi sia in cellule vive che fisse negli animali. La nostra sonda fluorescente può offrire un metodo semplice e rapido per studiare la dinamica dei perossisomi, l'eterogeneità e la disfunzione in modi precedentemente limitati.

Questo protocollo consentirà la ricerca basata su perossisomi basata sull'imaging in diversi tipi cellulari, incluse cellule derivate dal paziente con disturbi parossistici.