Determinazione della biomassa microbica nel suolo tramite Digital Droplet PCR (ddPCR)

Il nostro studio utilizza la PCR digitale a gocce e il sequenziamento del genoma completo per quantificare con precisione la biomassa microbica in vari tipi di suolo. I metodi convenzionali richiedono grandi campioni di terreno e sostanze chimiche nocive. ddPCR utilizza un suolo minimo per la quantificazione assoluta di geni e biomassa del carbonio.

Per cominciare, assemblare i reagenti del kit di estrazione del DNA del suolo per isolare il DNA dai microbi del suolo a 20 gradi Celsius a temperatura ambiente. Fai girare brevemente il tubo da due millilitri per battere le perline e verifica che le perline si siano depositate sul fondo. Aggiungi 100 milligrammi di terriccio, poi 800 microlitri di Solution CD1 e aggiungi un vortice brevemente per mescolare.

Utilizzare un omogeneizzatore a sfere a una velocità di sei metri al secondo per 40 secondi per lisare accuratamente il campione e centrifugare il tubo di battitura a perle a 15.000 g per un minuto a temperatura ambiente per ottenere la lisi meccanica delle cellule. Trasferire il sovrantantante che potrebbe ancora contenere particelle di suolo in un tubo pulito per microcentrifuga da due millilitri. Aggiungi 200 microlitri di Solution CD2.

Vortice per cinque secondi e centrifuga a 15.000 g per un minuto. Trasferire fino a 700 microlitri di sovrantante in un tubo pulito da due millilitri senza disturbare il pellet. Aggiungi 600 microlitri di Solution CD3 al sovrantato e al vortice per cinque secondi.

Carica 650 microlitri della miscela su una colonna di rotazione e centrifuga a 15.000 g per un minuto. Scartare il flusso e ripetere il processo per il lisato rimanente. Successivamente, posiziona la colonna centrifuga in un tubo pulito da due millilitri.

Aggiungi 500 microlitri di Solution EA alla colonna di spin e centrifuga a 15.000 g per un minuto a temperatura ambiente. Scartare il flusso attraverso e rimettere la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta. Aggiungere 500 microlitri di Soluzione C5 alla colonna di spin e alla centrifuga come dimostrato in precedenza.

Dopo aver scartato il flow-through, si posiziona la colonna di rotazione in un nuovo tubo di raccolta da due millilitri e centrifuga a 16.000 g per due minuti a temperatura ambiente. Posiziona la colonna rotante in un nuovo tubo di eluzione da 1,5 millilitri. Aggiungi da 50 a 100 microlitri della Soluzione C6 al centro della membrana del filtro della colonna di spin.

Centrifuga a 15.000 g per un minuto. Conserva il tubo contenente l'eluente a quattro gradi Celsius dopo aver scartato la colonna di rotazione. Quantificare il DNA estratto utilizzando un fluorometro e un kit di analisi a doppio filamento per il DNA a larga gamma seguendo le istruzioni del produttore.

Per l'analisi di batteri e funghi, selezionare specifici primer per rRNA 16S e RNRRN 18S. Dopo lo scongelamento, si fanno un vortice con tutti i reagenti sul ghiaccio. Imposta la Reazione a Catena della Polimerasi a Gocce Digitali, o ddPCR.

Inserisci la cartuccia generatore di gocce, o DG8, nel portacartuccie. Aggiungi un totale di 20 microlitri della miscela di reazione in ciascuno dei pozzi del campione nella cartuccia. Poi aggiungi 70 microlitri di olio per la generazione di gocce per Evagreen nell'olio ben etichettato con la cartuccia.

Metti la cartuccia nel generatore di gocce e coprila con una guarnizione. Trasferire 40 microlitri delle gocce generate in ciascun pozzo di una piastra semi-gonnata da 96 pozzi per l'amplificazione PCR. Sigilla la piastra usando un sigillante preimpostato a 180 gradi Celsius per cinque secondi.

Configura il profilo di ciclo termico e imposta il coperchio riscaldato a 105 gradi Celsius. Dopo il completamento della PCR, trasferire la piastra a 96 pozzi al lettore di placche. Utilizzando la versione 2.1 di QuantaSoft, regola la soglia di ampiezza per separare gocce negative e positive.

Da ogni pozzo, valuta i parametri, come il numero di copie geniche per nanogrammo di DNA, il totale delle copie geniche per nanogrammo di DNA estratto, le copie geniche per grammo di peso secco del suolo lavorato durante l'estrazione e il numero di cellule per grammo di peso secco del suolo. Inoltre, calcola il Carbonio da Biomassa Microbica, o MBC, corrispondente a batteri e funghi per grammo di peso secco del suolo per pozzo. L'analisi triplicata del DNA del suolo da cinque località ha prodotto concentrazioni medie di DNA microbico che variano da 32 nanogrammi a 4.590 nanogrammi per grammo di terreno asciutto per campione.

Il suolo B conteneva il minor numero di copie del gene 16S rRNA, con una media di 8,8 volte 10, con la potenza di sette e con le copie del gene rRNA 18S, con una media di 4,6 volte 10, con una potenza di sei per grammo di terreno secco. Al contrario, il Suolo E ha avuto i conteggi più alti di copie geniche del rRNA 16S e 18S, con una media di 4,4 volte 10 al valore di nove e 2,5 volte 10 al valore di nove per grammo di terreno secco, differenziando significativamente da tutti gli altri campioni. Sebbene le copie fungine siano rimaste simili tra i suoli A, B, C ed D, i conteggi batterici nel suolo D differivano significativamente sia da B che da E. Il contenuto microbico più alto è stato osservato nel suolo E, mentre il contenuto microbico più basso è stato trovato nei campioni raccolti dal suolo B che differiscono significativamente da A, D ed E. Questo protocollo consente ai ricercatori di misurare la dinamica e la struttura delle comunità del suolo attraverso la biomassa microbica e il rapporto fungo-batterico.

Lo stesso DNA modello utilizzato per la PCR digitale a gocce può essere impiegato per il sequenziamento del DNA, consentendo l'analisi della comunità microbica e funzionale.