Name: Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri l'imaging del calcio a risoluzione singola cellula in colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione automatizzata basata su machine learning. Questo metodo computazionale consente analisi ad alto rendimento e non soggetta a bias del segnale calcico.

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<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Jairaman, A., Prakriya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+airway+epithelial+cells%3A+Current+understanding+and+implications+for+inflammatory+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).</li>
<li>Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+storage+in+health+and+disease%3A+a+dynamic+equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium.</a> Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).</li>
<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), e1796(2008).</li>
<li>Ren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+protects+RPE+cells+from+necroptosis+and+NLRP3+activation+via+promoting+SERCA2-related+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis.</a> Phytomedicine. 135, 156088(2024).</li>
<li>Dwivedi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TMEM16A+blockers+benzbromarone+and+MONNA+cause+intracellular+Ca2%2B+release+in+mouse+bronchial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells.</a> Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, e1067(2009).</li>
<li>Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%5BCa2%2B%5Di+in+whole+cell+suspensions+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2.</a> Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).</li>
<li>Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+secretion+and+sequestration+in+macrophages.+A+blocker+of+organic+anion+transport+reveals+that+these+processes+occur+via+a+membrane+transport+system+for+organic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions.</a> J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ca2%2B+indicator+for+long-term+tracking+of+intracellular+calcium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux.</a> BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).</li>
<li>Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+immunological+barriers+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and immunological barriers in the lung.</a> Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).</li>
<li>Quach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+human+fetal+lung+atlas+reveals+the+temporal+dynamics+of+epithelial+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity.</a> Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).</li>
<li>Deprez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+human+healthy+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the human healthy airways.</a> Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).</li>
<li>Prescott, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+in+vitro+air-liquid+interface+culture+models+of+the+human+airway+epithelium+evaluating+cellular+heterogeneity+and+gene+expression+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution.</a> Respir Res. 24 (1), 213(2023).</li>
<li>Gunawardena, T. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+fluorescence-based+measurements+of+modulator+efficacy+in+nasal+epithelial+cultures+derived+from+people+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis.</a> Cells. 12 (8), 1174(2023).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rescue+of+c.3846G%3EA+%28W1282X%29+in+patient-derived+nasal+cultures+achieved+by+inhibition+of+nonsense-mediated+decay+and+protein+modulators+with+complementary+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action.</a> J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).</li>
<li>Terrance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+nasal+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human nasal epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).</li>
<li>Perniss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+succinate%2FSUCNR1-brush+cell+defense+program+in+the+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium.</a> Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).</li>
<li>Sehgal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+%28ER%29+Ca2%2B-ATPase+by+thapsigargin+analogs+induces+cell+death+via+ER+Ca2%2B+depletion+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response.</a> J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).</li>
<li>Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/cal-520-am">https://www.aatbio.com/products/cal-520-am</a> (2025).</li>
<li>Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552">https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552</a> (2025).</li>
<li>Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+world+upside-down+in+cellulose+for+improved+culturing+and+imaging+of+respiratory+challenges+within+a+human+3D+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model.</a> Cells. 8 (10), 1292(2019).</li>
<li>Becker, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+airway+epithelium+reveals+that+mucociliary+clearance+modulates+SARS-CoV-2+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread.</a> Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>piastra a 24 pozzi &nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>inserti transwell a 24 pozzi &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre in polistirene nero trasparente a 96 pozzi a 96 pozzi</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520 AM</td><td>AAT Bioquest&nbsp;</td><td>21130</td><td>Attribuito e conservato a -20&grad; C, sciolto nel DMSO</td></tr><tr><td>Software per la Suite del Calcio</td><td>Il codice può essere richiesto contattando il nostro gruppo di laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMEM, 1xs</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>320-005-CL</td><td>Conservato a 4°Deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>080-450</td><td>Attribuito e conservato a -20&grad; C</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM & nbsp;</td><td>AAT Bioquest&nbsp;</td><td>20550</td><td>Attribuito e conservato a -20&grad; C, sciolto nel DMSO</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>H3570</td><td>Conservato a 4°Deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Linea cellulare dell'adeoncarcinoma colorettale epiteliale umano &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>7786-30-3</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Micropiatto 35mm, fondo di vetro basso</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80137</td><td>Conservato a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione penicillina-streptomicina</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>450-200-EL</td><td>Conservato a 4°Deg; C</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>3111-010-CL</td><td>Conservato a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>7447-40-7</td><td>Conservato a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Probenecid&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>P36400</td><td>Attribuito e conservato a -20&grad; C, solubile in acqua e nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio &nbsp;</td><td>Bioshop&nbsp;</td><td>SOD004</td><td>Conservato a temperatura ambiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Thapsigargin&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>T7458</td><td>Attribuito e conservato a -20&grad; C sciolto in DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzima Triple Express (1X), fenolo rosso &nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>12605010</td><td>Conservato a 4°Deg; C</td></tr></tbody></table>

imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata

Fluorescence-Based Calcium Imaging in Primary Human Airway Epithelial Cultures Using Automated Cell Segmentation

Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata

Calcium signaling is critical in a multitude of biological processes, reinforcing the need to develop methods to study calcium flux in primary tissue. The ...

fluorescence-based-calcium-imaging-primary-human-airway-epithelial

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Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l'input minimo da parte dell'utente e pregiudizi.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Presentiamo un protocollo per effettuare misurazioni dinamiche del pH liquido superficiale delle vie respiratorie in condizioni di pellicola sottile utilizzando un lettore di piastre.

Misurazione fluorescente semi-automatizzata in tempo reale del pH liquido superficiale delle vie respiratorie delle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Questo protocollo descrive la raccolta, l'espansione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali in modelli organotipici di cellule epiteliali delle vie aeree e la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia tramite imaging di cellule vive e script personalizzati.

Raccolta, espansione e differenziazione di modelli primari di cellule epiteliali nasali umane per la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia

Il protocollo descrive un bioreattore abilitato all'imaging che consente la rimozione selettiva dell'epitelio endogeno dalla trachea di ratto e la distribuzione omogenea di cellule esogene sulla superficie del lume, seguita da una coltura in vitro a lungo termine del costrutto cellula-tessuto.

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo. La calcificazione vascolare contribuisce in modo sostanziale al carico di morbilità e mortalità cardiovascolare. Questo protocollo descrive un metodo semplice per quantificare la precipitazione di calcio mediata da cellule muscolari lisce vascolari in vitro mediante imaging fluorescente.

Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro

Abbiamo sviluppato una tecnica di processamento tissutale che utilizza un vibratomo e tessuto polmonare incorporato in agarosio per generare sezioni polmonari, consentendo così l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione dell'architettura polmonare. Abbiamo utilizzato la colorazione a immunofluorescenza per osservare l'espressione spaziale delle proteine utilizzando specifici marcatori strutturali polmonari.

Sezionamento automatizzato con vibratomo del tessuto polmonare incorporato nell'agarosio per l'imaging a fluorescenza multiplex

Qui presentiamo un dispositivo innovativo che applica forme d'onda di deformazione isotrope e uniassiali alle cellule, supportando al contempo la coltura su substrati con rigidità sintonizzabile e matrici proteiche personalizzabili. Questa piattaforma semplice ed economica consente ai ricercatori di indagare come i segnali meccanici regoli la funzione cellulare sia in studi fondamentali che in contesti rilevanti per la malattia.

Una piattaforma innovativa per lo stretching e l'imaging cellulare in vitro

Scopri l'imaging del calcio a risoluzione singola cellula in colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione automatizzata basata su machine learning. Questo metodo computazionale consente analisi ad alto rendimento e non soggetta a bias del segnale calcico.

Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata (Video) | JoVE Journal

Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata

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