Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata

La trascritomica a singola cellula rivela eterogeneità nell'epitelio delle vie aeree con fibrosi cistica. Intendiamo comprendere come le funzioni e i cambiamenti specifici per tipo cellulare influenzino la patogenesi della malattia. La sfida attuale è misurare con precisione la proteomica e le funzioni di singola cellula.

Questo richiede ancora sviluppo tecnico. Per cominciare, mantenere le cellule di Calu-3 in fiaschette T-25 contenenti il mezzo essenziale minimo di Eagle integrato con 20% FBS e 1% di penicillina streptomycin. Quando le cellule raggiungono circa il 70% di confluenza, lavare le cellule con cinque millilitri di PBS.

Dopo il lavaggio, aggiungi un millilitro di TrypLE direttamente sulle celle e metti la fiaschetta in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 10-15 minuti. Poi neutralizza il TrypLE aggiungendo quattro millilitri di mezzo di coltura fresco e completo e mescolando accuratamente la sospensione cellulare. Placca le celle in una piastra da 96 pozzi con una confluenza approssimativamente dal 90%-100%, corrispondente a circa 40.000 celle per pozzo.

Lascia che le celle si attacchino alla piastra a 96 pozzi durante tutta la notte. Cambia il substrato ogni giorno e continua a coltivare le cellule per due o cinque giorni dopo la confluenza per permettere la differenziazione. Il giorno dell'esperimento, lavare le cellule di Calu-3 e incubarle con coloranti appropriati.

Successivamente, aggiungi 100 microlitri per pozzo di probenecide da 2,5 millimolari diluito in tampone di calcio per mantenere il colorante nello spazio citoplasmatico e avvolgi la piastra in carta stagnola di alluminio per proteggerla dalla luce fino all'immagini. Per le cellule primarie delle vie aeree. Rimuovere il substrato basolaterale dal pozzetto di trasmissione e lavare il lato apicale aggiungendo 300 microlitri di tampone di calcio.

Poi lava il lato basolaterale aggiungendo 750 microlitri di tampone di calcio. Rimuovi il buffer pipettando e ripeti il lavaggio ancora una volta su entrambi i lati. Successivamente, incubare le cellule con 200 microlitri di soluzione di colorante sul lato apicale e 600 microlitri sul lato basolaterale per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Durante l'incubazione, preparare la thapsigargin diluita in tampone di calcio come stock intermedio tre volte. Regolare la concentrazione a sei micromolari per ottenere una concentrazione finale di due micromolari nel pozzo. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di colorante sia dal compartimento apicale che da quello basolaterale tramite pipetta.

Lavare le cellule due volte con 300 microlitri di tampone di calcio sul lato apicale e 750 microlitri di tampone di calcio sul lato basolaterale. Poi rimuovi il buffer tramite pipettaggio. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di probenecide 2,5 millimolari in tampone di calcio nel compartimento apicale, e aggiungere 500 microlitri della stessa soluzione nel compartimento basolaterale.

Tenendo l'inserto transwell all'interno della piastra di alluminio, avvolgi l'intera piastra in carta di alluminio per proteggerla dalla luce e metti da parte la piastra avvolta per l'immagini. Apri la domanda per le Fiji. Seleziona File e scegli Aperta per caricare il file video.

Nella finestra pop-up risultante, mantieni tutte le impostazioni predefinite e conferma la selezione. Se desiderato, regola la visualizzazione dell'immagine selezionando Immagine, selezionando Modifica e cliccando su Contrasto di luminosità. Modifica la luminosità e il contrasto dei singoli canali di fluorescenza per ottenere una visuale ottimale delle cellule.

Per facilitare il tracciamento delle celle unisci i canali selezionando Immagine, scegliendo Colore e cliccando su Ungi Canali. Nella finestra pop-up, assegna i file appropriati a ogni singolo canale e conferma la selezione. Per il tracciamento, seleziona Analizza, Scegli Strumenti e apri ROI Manager.

Nella finestra pop-up risultante, attiva sia le opzioni Mostra Tutto che Etichetta. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, traccia con attenzione le singole cellule in base ai confini cellulari e alla colorazione nucleare. Poi premi il tasto T per aggiungere ogni cella tracciata alla lista ROI.

Assicurati che le celle siano tracciate in tutti e quattro gli angoli del campo visivo e al centro del video. Una volta che tutte le celle sono state tracciate accuratamente, all'interno della finestra ROI Manager, clicca su Altro e seleziona Multi Measure. Nella finestra popup risultante, premi OK per iniziare la misurazione.

Apri il file video nelle Fiji. Ottimizzare i canali di fluorescenza nucleare e verde per la visualizzazione utilizzando gli strumenti di regolazione dell'immagine. Una volta ottimizzati i canali, duplica un singolo fotogramma selezionando Immagine e scegliendo Duplica.

Nella finestra pop-up risultante, deseleziona Duplicato stack e salva l'immagine duplicata come file immagine PNG. Ripeti la duplicazione del fotogramma per l'altro canale selezionando Immagine e Duplica. Nella finestra pop-up, premi OK e salva l'immagine come file PNG.

Unisci le due immagini salvate selezionando Immagine, scegliendo Colore e cliccando su Ungi i canali. Poi assegna ogni file PNG al canale appropriato e conferma la fusione. Carica l'immagine unita nella cella dopo l'interfaccia grafica per generare una maschera cellulare.

Segmentare l'immagine usando la colorazione nucleare come canale uno e la colorazione citoplasmatica come canale due selezionando il modello cyto3. Ora, salva l'immagine della maschera generata come file PNG. Aprilo a Fiji e convertilo in un file TIFF.

Infine, apri sia il file della maschera che il file video originale nella suite calcio trascinandoli e rilascandoli nell'interfaccia software. Clicca su Analizza dati per generare un grafico scaricabile e un file CSV scaricabile contenente valori di intensità normalizzati e grezzi per tutte le celle analizzate. L'intensità della fluorescenza normalizzata alla fase basale è aumentata nel tempo nelle singole cellule Calu-3 dopo la stimolazione della thapsigargin quando misurata sia con Fluo-4 AM che con Cal-520 AM; la massima attivazione della fluorescenza dipendente dal calcio dopo la thapsigargin è stata significativamente più alta nelle cellule Calu-3 misurate con Cal-520 AM rispetto a Fluo-4 AM. Analogamente, le singole cellule primarie delle vie aeree e bronchiali hanno mostrato una fluorescenza normalizzata aumentata nel tempo dopo la stimolazione con thapsigargin utilizzando uno dei coloranti.

Inoltre, l'attivazione massima della fluorescenza dipendente dal calcio è stata significativamente più alta nelle cellule cariche di Cal-520 AM. L'analisi basata su apprendimento automatico ha identificato e quantificato i cambiamenti di fluorescenza dipendente dal calcio in 1.441 singole cellule, da un unico campo di visione. Le tracce di fluorescenza normalizzate generate dal software hanno mostrato risposte di calcio per tutte le 1.441 cellule identificate dopo la stimolazione della thapsigargin. I nostri studi aiuteranno a comprendere le risposte dei distinti tipi cellulari al loro ambiente, il che favorirà lo sviluppo di terapie mirate.

I nostri risultati hanno il potenziale di individuare tipi cellulari distinti, assegnando certe risposte cellulari vive a stimoli ambientali. In futuro, intendiamo esplorare come la segnalazione specifica per tipo cellulare nelle malattie e nelle cellule sane venga modificata per determinare i tipi responsabili.