Configurazione riproducibile per l'imaging a due fotoni in vivo della contrattibilità dei vasi linfatici cervicali e del flusso linfatico nei topi

Presentiamo la necessità di una nuova imaging della contrattilità dei vasi linfatici cervicali e della rimozione linfatica dei globuli rossi nei topi. Studiare le funzioni dei vasi linfatici cervicali è impegnativo, soprattutto quando è necessaria un'osservazione a lungo termine della contrattilità del flusso linfatico e delle circolazioni traccianti. Per cominciare, posizionare una rotaia ottica in acciaio lunga 270 millimetri e larga 43 millimetri come base del dispositivo.

Installare due portapali sopra la rotaia ottica in acciaio, garantendo una distanza di 175 millimetri tra di essi. Inserire due montanti di montaggio con un diametro di 12 millimetri nei portaperoni e fissarli ciascuno con una vite M6. Poi attacca un collare per il palo a ciascuno dei due montanti.

Fissa una pinza a perno fisso ad angolo retto a uno dei montanti di montaggio e fissala saldamente usando una vite M6. Inserire un perno di montaggio da 12 millimetri nel foro laterale della morsa del perno ad angolo retto. Fissa un portaoggetti stampato in 3D al montante laterale inserito e fissalo saldamente usando due paia di viti M3.

Utilizzando colla polimerizzabile UV, fissa un vetro di copertura di 12 millimetri di diametro sotto una custodia protettiva stampata in 3D. Poi fissa la custodia protettiva al porta-stampa 3D usando una coppia di vite M4/dado. Installa un tavolo pantografico di precisione per il movimento verticale sulla base della rotaia ottica in acciaio usando due clip per il tavolo e set di viti, dadi e rondelle M6.

Poi posiziona una custodia stampata in 3D di 155 millimetri di lunghezza e 110 millimetri di larghezza sul tavolo. Questa custodia funge da serbatoio per l'accumulo di soluzione salina. Copri il punto di connessione dei fili all'elemento riscaldante uno con uno strato sottile di silicone.

Fissa il sensore di temperatura uno al tappetino e sigillalo con silicone. Salda i fili dell'elemento riscaldante e dei sensori di temperatura a un cavo multifilo. Riempi il punto di connessione con silicone e chiudilo usando pellicola termoassorbente.

Inserisci l'elemento riscaldante due e il sensore di temperatura due nel rullo in schiuma. Fissa i connettori per il cavo di alimentazione e il pulsante di accensione alle pareti della custodia dell'unità di controllo. Installa un alimentatore a corrente continua da 24 volt, un convertitore a corrente continua e due moduli MOSFET all'interno dell'involucro.

Dopo aver assemblato il circuito e saldato i componenti necessari, fissa l'Arduino Uno e lo schermo della tastiera nella custodia del coperchio. Localizza il campo di selezione della temperatura. Regola la temperatura e premi il run.

Dopo aver anestetizzato il topo, applica pomata per gli occhi su entrambe le palpebre per evitare la secchezza degli occhi durante l'intervento. Quando il riflesso di ritiro delle zampe posteriori e il riflesso di raccolta della coda cessano, posiziona il topo sulla schiena sull'elemento riscaldante per consentire l'accesso alla regione addominale. Collega l'unità di controllo a una presa elettrica con una tensione di ingresso da 175 a 240 volt in corrente alternata.

Usando il nastro medico, fissa il corpo dell'animale in una posizione parallela alla superficie del tavolo e posiziona la testa ad angolo rispetto all'asse sagittale in modo che un lato del collo poggi sul rullo. Avvolgi una legatura attorno agli incisivi superiori e fissala sul retro del dispositivo, utilizzando il nastro medico per aiutare a mantenere la temperatura corporea dell'animale. Poi, radere il pelo dalla zona del collo.

Poi rimuovi eventuali peli sciolti rimasti e copri l'animale per preservare il campo sterile. Per la disinfezione primaria, disinfettare la pelle del collo usando un tampone alcolico. Poi applica una soluzione di clorexidina al 0,5% o una soluzione di iodio al 2% per il trattamento antisettico e ripeti il processo di disinfezione altre due volte.

Dopo aver confermato la profondità anestetica tramite riflesso di pizzicamento delle dita, eseguire una dermatotomia effettuando un'incisione longitudinale lungo la pelle del collo dalla mandibola inferiore fino alla clavicola, lunga circa due centimetri. Poi esegui una fasciotomia usando forbici curve microchirurgiche. Usando pinzette curve, sposta delicatamente da parte le ghiandole salivari e i muscoli superficiali del collo per esporre il muscolo sternocleidomastoideo.

Assicurati che i vasi sanguigni visibili non vengano danneggiati e inumidisce continuamente il campo chirurgico con soluzione salina per prevenire danni ai tessuti. Utilizzare forbici microchirurgiche per eseguire una miotomia del muscolo sternocleidomastoideo, fornendo accesso alla regione tra trachea e arteria carotide. Continua a disperdere muscoli e fascia, eseguendo sia la miotomia che la fasciotomia.

Successivamente, individuare il linfonodo cervicale profondo insieme ai vasi linfatici afferenti ed efferenti a una profondità di cinque-sette millimetri. Posiziona il dispositivo che tiene l'animale fisso sul tavolo mobile del microscopio. E fissare il dispositivo in posizione fissandolo saldamente con una vite M6 per garantire stabilità durante l'immagini.

Fissa il catetere, pre-riempito con soluzione salina, al palo di montaggio usando nastro medico. Posizionare un rullo con un diametro di un centimetro sotto l'elemento riscaldante sul lato della testa dell'animale per mantenere un'inclinazione di 45 gradi rispetto al tavolo del microscopio. Poi posiziona il catetere fisso nell'area del collo aperta chirurgicamente in modo che si trovi vicino alla regione della clavicola dell'animale e attiva la soluzione salina per riempire la cavità aperta del collo con soluzione salina.

Abbassare la custodia protettiva sull'area del collo riempita di soluzione salina in modo che il vaso linfatico si trovi al centro del campo di osservazione. Poi posiziona il involucro protettivo sulla trachea senza esercitare pressione. Infine, abbassare la lente a due fotoni non immersiva in acqua nella custodia protettiva alla profondità corretta in base alla distanza di lavoro della lente ed eseguire la visualizzazione a due fotoni del vaso linfatico cervicale.

Dopo la procedura, l'identificazione riuscita dei linfonodi cervicali profondi è stata confermata dall'accumulo di Evans Blue nel tessuto. Il monitoraggio a due fotoni della contrattilità del vaso linfatico cervicale è stato effettuato prima e dopo la fotobiomodulazione. La fotobiomodulazione ha aumentato significativamente la contrattibilità del vaso linfatico cervicale nei topi di 2 e 18 mesi con intensità simile.

L'analisi quantitativa ha mostrato che la contrattibilità dei vasi linfatici cervicali era significativamente inferiore nei topi di 24 mesi rispetto a quelli di 2 e 18 mesi. Tuttavia, i valori non sono stati significativamente diversi tra topi di 2 e 18 mesi. La fotobiomodulazione ha aumentato significativamente la contrattibilità dei vasi linfatici cervicali nei topi di 2 e 18 mesi, ma non ha avuto effetto nei topi di 24 mesi.

I globuli rossi iniettati nel ventricolo laterale destro sono stati osservati nei vasi linfatici cervicali quattro ore dopo l'iniezione e hanno continuato a muoversi attraverso il lume a cinque ore, confermando il flusso direzionale dal cervello alla periferia. Il nostro protocollo facilita il monitoraggio in vivo della funzione dei vasi linfatici cervicali, mantenendo la contrattilità per un massimo di cinque ore di osservazione. Il nostro metodo offre una buona riproducibilità ed è compatibile con vari microscopi a due fotoni e obiettivi oggettivi, mantenendo al contempo un'immagine di alta qualità con profondità fino a 500 micrometri.

Questa tecnica può potenzialmente diventare uno strumento universale per studiare la fisiologia del sistema di drenaggio cerebrale e le funzioni dei vasi linfatici cervicali.