Name: In vitro Test di riassociazione per misurare la formazione di particelle ribosomiche 80S utilizzando subunità ribosomiche lavate con sale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Scopri il test di riassociazione in vitro per analizzare la formazione di particelle ribosomiche 80S utilizzando subunità lavate con sale. Questo metodo permette di studiare le interazioni tra subunità ribosomiche e i meccanismi della sintesi proteica.

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<ol><li>Hinnebusch, A. G., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation%3A+new+insights+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation: new insights and challenges.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (10), a01154(2012).</li>
<li>Fringer, J. M., Acker, M. G., Fekete, C. A., Lorsch, J. R., Dever, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+release+of+eukaryotic+translation+initiation+factors+5B+and+1A+from+80S+ribosomes+following+subunit+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupled release of eukaryotic translation initiation factors 5B and 1A from 80S ribosomes following subunit joining.</a> Mol Cell Biol. 27 (6), 2384-2397 (2007).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Kisly, I., Tamm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaea%2Feukaryote-specific+ribosomal+proteins%3A+guardians+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Archaea/eukaryote-specific ribosomal proteins: guardians of a complex structure.</a> Comput Struct Biotechnol J. 21 (1), 1249-1261 (2023).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Gossen, M., Dittmar, G., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+cellular+protein+translation+by+pulsed+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC.</a> Proteomics. 9 (1), 205-209 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Kisly, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+eL19+and+eB12+intersubunit+bridge+in+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional role of eL19 and eB12 intersubunit bridge in the eukaryotic ribosome.</a> J Mol Biol. 428 (10 Pt B), 2203-2216 (2016).</li>
<li>Kisly, I., Remme, J., Tamm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+protein+eL24%2C+involved+in+two+intersubunit+bridges%2C+stimulates+translation+initiation+and+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribosomal protein eL24, involved in two intersubunit bridges, stimulates translation initiation and elongation.</a> Nucleic Acids Res. 47 (1), 406-420 (2019).</li>
<li>Tamm, T., Kisly, I., Remme, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+of+ribosomal+intersubunit+bridges+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional interactions of ribosomal intersubunit bridges in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 213 (4), 1329-1339 (2019).</li>
<li>Konikkat, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+60S+ribosomal+subunit+assembly+emerging+from+recent+studies+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Principles of 60S ribosomal subunit assembly emerging from recent studies in yeast.</a> Biochem J. 474 (2), 195-214 (2017).</li>
<li>Steffen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+deficiency+protects+against+ER+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome deficiency protects against ER stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 191 (1), 107-118 (2012).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Getting started with yeast.</a> Methods Enzymol. 350 (1), 3-41 (2002).</li>
<li>Liiv, A., O'Connor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+intersubunit+bridge+regions+of+23S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutations in the intersubunit bridge regions of 23S rRNA.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29850-29862 (2006).</li>
<li>Kipper, K., Hetényi, C., Sild, S., Remme, J., Liiv, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+intersubunit+bridge+B2a+is+involved+in+factor-dependent+translation+initiation+and+translational+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal intersubunit bridge B2a is involved in factor-dependent translation initiation and translational processivity.</a> J Mol Biol. 385 (2), 405-422 (2009).</li>
<li>Lilleorg, S., Reier, K., Remme, J., Liiv, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intersubunit+bridge+B1b+of+the+bacterial+ribosome+facilitates+initiation+of+protein+synthesis+and+maintenance+of+translational+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The intersubunit bridge B1b of the bacterial ribosome facilitates initiation of protein synthesis and maintenance of translational fidelity.</a> J Mol Biol. 429 (7), 1067-1080 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4-(2-idrossietil)-1-piperazina, etanosolfonico (HEPES)</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Tappi di bottiglia centrifuga da 70 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>355623</td><td></td></tr><tr><td>Akta UVIS-920-Monitor</td><td>GE Health</td><td>70407</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&nbsp; Filtro Ultra Centrifugo, 100 kDa MWCO, 15 mL</td><td>Millipore</td><td>UFC9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito bacto</td><td>Gibco</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Punte di pipetta graduate blu, 1000 & micro; L</td><td>Consiglio Una</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione con tappo di bottiglia, imbuto solo 500 mL</td><td>Starlab</td><td>CC8222-5226</td><td></td></tr><tr><td>Piastra magnetica di agitazione C-Mag HS 7</td><td>IKA</td><td>S000</td><td></td></tr><tr><td>Affresco Biofuge della Centrifuga</td><td>Heraeus Instruments</td><td>75005510/01</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie centrifughe 600 mL</td><td>Hettich</td><td>0551</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Rotina 420R & nbsp;</td><td>Hettich</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Rotore oscillante della centrifuga&nbsp;</td><td>Hettich</td><td>4784-A+4780+4783</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio monoidrato</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11090.36</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette usa e getta 1,5 mL</td><td>Plastibrand</td><td>759015</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubi centrifughe conici</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro (& Oslash; 0,25-0,5 mm)</td><td>Carl Roth</td><td>A553.1</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di gradienti volume totale di 100 mL</td><td>Strumenti Scientifici Hoefer</td><td>SG100</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Maker 30 mL volume totale &nbsp;</td><td>Strumenti Scientifici Hoefer</td><td>SG30</td><td></td></tr><tr><td>Blocco secco di riscaldamento/raffreddamento CH-100</td><td>BioSan</td><td>BS-010410-CAI</td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubatore Multitron</td><td>Infors HT</td><td>NC1666704</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (C3H7OH)</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido (N2)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrato di acetato di magnesio (Mg(OAc)2 e toro 4H2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7008,0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta con segni circolari, 100 & micro; L</td><td>Marienfeld</td><td>2920116</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Oscillatore orbitale</td><td>Sanyo</td><td>Mir-S100C</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica PD 5201</td><td>Heidolph</td><td>523-52019-00</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsolsolfinilfluoro (PMSF)</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td>La PMSF è l'unico inibitore proteasi utilizzato in questo metodo.</td></tr><tr><td>Bottiglie centrifughe in policarbonato, 70 mL, 38 x 102 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Tubi centrifughe in polipropilene, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tubi centrifughe in polipropilene, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>AppliChem</td><td>A3582.1000</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Lach-Ner</td><td>UN1813</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Precellys 24</td><td>Bertin Technologies</td><td>P000669-PR-240-A</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di reazione 3810X 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Safe-Lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcentrifuga a tappo a vite, 2 mL</td><td>VWR</td><td>525-1146</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica 10 mL</td><td>Nerbe Plus</td><td>12-461-9208</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica 25 mL</td><td>Nerbe Plus</td><td>12-481-9102</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Ultrospec 2000</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>CGS 8162.39</td><td></td></tr><tr><td>Sucrosio (C12H22O11)</td><td>Carl Roth</td><td>9097.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotore a canna oscillante SW28</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Rotore a canna oscillante SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>TRNA da E. coli MRE 600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Punte gialle della pipetta, 5-200 e micro; L</td><td>Thermo Scientific</td><td>94300120</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro test di riassociazione per misurare la formazione di particelle ribosomiche 80s utilizzando subunità ribosomiche lavate con sale

In Vitro Reassociation Assay to Measure the Formation of 80S Ribosomal Particles Using Salt-washed Ribosomal Subunits

In vitro Test di riassociazione per misurare la formazione di particelle ribosomiche 80S utilizzando subunità ribosomiche lavate con sale

Ribosomes are molecular machines that are responsible for protein synthesis in all living cells. All ribosomes consist of two subunits. In eukaryotes, the ...

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Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

Un ostacolo importante per le analisi biochimiche dei ribosomi contenente nascente peptidil-tRNA è stata la presenza di ribosomi altri nei medesimi campioni, i ribosomi non coinvolti nella traduzione della sequenza di mRNA specifico oggetto di analisi. Abbiamo sviluppato una metodologia semplice per purificare, esclusivamente, i ribosomi contenente il nascente peptidil-tRNA di interesse.

Isolamento dei ribosomi Tradurre contenenti peptidil-tRNA per le analisi funzionali e strutturali

Contaminazione di preparati di ribosomi eucarioti purificata con metodi tradizionali da parte di co-purificazione nucleasi e proteasi influisce negativamente sulla valle analisi biochimiche e strutturali. Un metodo rapido e semplice purificazione cromatografica viene utilizzato per risolvere questo problema utilizzando ribosomi lievito come sistema modello.

Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active

Una tecnica per identificare i siti di pausa traslabile su mRNA viene descritto. Questa procedura è basata su isolamento di polipeptidi nascenti accumulano sui ribosomi durante traduzione in vitro di un mRNA bersaglio, seguita dall'analisi dimensione delle catene nascenti elettroforesi utilizzando un gel denaturante.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

Descriviamo qui una tecnica che viene ora utilizzato di routine per isolare complessi ribosoma stabilmente legati a catena nascente (RNC). Questa tecnica sfrutta la scoperta che un 17 aminoacidi lungo "sequenza di arresto" SECM può fermare l'allungamento traduzione in un procariota...

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Il monitoraggio dei singoli eventi di traduzione consente studi cinetici ad alta risoluzione sui meccanismi di traduzione dipendenti dal cappuccio. Qui dimostriamo un saggio a singola molecola in vitro basato sulle interazioni di imaging tra anticorpi etichettati fluorescentmente e peptidi nascenti etichettati epitopi. Questo metodo consente la caratterizzazione a singola molecola della cinetica di iniziazione e allungamento peptidico durante la traduzione attiva in vitro dipendente dal...

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Il trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola è un metodo che traccia la dinamica del tRNA durante la sintesi proteica ribosomiale. Tracciando i singoli ribosomi, vengono identificate popolazioni disomogenee, che fanno luce sui meccanismi. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti conformazionali biologici in generale per rivelare relazioni dinamico-funzionali in molti altri biosistemi complessi. I metodi a singola molecola possono osservare passaggi non...

Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Questo protocollo descrive un metodo per ubiquitinare Streptococcus pneumoniae utilizzando lisato cellulare di mammifero o complesso enzimatico puro ubiquidina, seguito da un trattamento con complesso proteico purificato VCP/p97-UFD1-NPLOC4 per valutarne l'attività batteriolitica, consentendo lo studio degli effettori immunitari dipendenti da ubiquidina.

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

Scopri il test di riassociazione in vitro per analizzare la formazione di particelle ribosomiche 80S utilizzando subunità lavate con sale. Questo metodo permette di studiare le interazioni tra subunità ribosomiche e i meccanismi della sintesi proteica.

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