Name: Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri la microscopia di localizzazione di singole molecole su cellule intere tramite DNA-PAINT con microscopio confocale a disco rotante e riassegnazione ottica dei fotoni. Questo protocollo semplificato elimina l'ottica personalizzata.

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<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
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<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
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<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
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<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
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<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Idrossi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-acido carbossilico</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-Diidrossibenzoico & nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60 e volte; Obiettivo Apo NA 1.49</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA colonna di desalinizzazione di spin contenente resina di esclusione di dimensione &nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Colonne di Desalinizzazione Zeba Spin per il passo 2.4</td></tr><tr><td>Accutasi - Mezzo di distacco delle cellule enzimatiche</td><td>Cellula promozionale</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP abbinato a DNA personalizzato (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Fotonica di massa</td><td>Prodotto personalizzato</td><td>Nanocorpi anti-GFP per Drosophila</td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP accoppiato con DNA</td><td>Fotonica di massa</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>Nanocorpi anti-GFP per NUP</td></tr><tr><td>Anti-alfa tubulina (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG</td><td>Fotonica di massa</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondario sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Tubo centrifugo conico 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrifugo conico 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio SDC-OPR</td></tr><tr><td>Desalinizzazione delle colonne di spin con Sephadex G-25 (resina di esclusione di dimensioni per purificazione del DNA) e nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marchio: Cytiva. Colonne G-25 per il passo 2.5</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Media DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anidro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MP Biomedici</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimide-PEG2-succinimidyl&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Media 5A di McCoy</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-morfolino)acido etanosolfenonico)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Tubi microcentrifughe 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Tubi microcentrifughe 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis a microvolume</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticelle 90 nm - Oro</td><td>Citodiagnostica</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CMOS Orca Fusion-BT</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 1x)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldeide (w/v), senza metanolo</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuato 3,4-Diossigenasi &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sodio&nbsp; Idrossido</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo TOM20</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tampone tris</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Preadolescente-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione centrifuga a ultrafiltrazione, MWCO 100 kDa</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Produttore: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Pozzo Alto Fondo di vetro</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 Fondo di vetro</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite dna-paint su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Per dimostrare le capacità di imaging super-resolution del sistema SDC-OPR (Figura 1A), la sua risoluzione in piano è stata valutata eseguendo esperimenti di imaging DNA-PAINT (Figura 1B) su complessi di pori nucleari (NPC), che costituiscono una struttura biologicadi riferimento 17. La Figura 1C mostra un'immagine rappresentativa DNA-PAINT SDC-OPR della nucleoporina 96 (Nup96), contrassegnata con proteina fluorescente verde monomerica potenziata (mEGFP) e marcata con nanocorpi anti-GFP coniugati con DNA, nelle cellule U2OS. I pannelli ingranditi rivelano la sottostruttura NUP, e la Figura 1D mostra proteine Nup96 accoppiate (indicate da frecce) coerenti con la simmetria 8 volte attesa dei pori nucleari. Nella Figura 1E, la distanza euclidea tra le coppie Nup96 è stata misurata allineandole e tracciando l'istogramma della sezione trasversale dell'immagine sommata (n = 16 coppie). L'analisi ha rivelato una separazione picco-picco di (13 ± 2) nm (Figura 1E), in accordo con i risultati dei modelli EM così come con l'imaging HILO eTIR 23. Ogni adattamento di picco mostrava una deviazione standard di 4 nm, confermando l'alta precisione di localizzazione (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) ottenuta usando DNA-PAINT su SDC-OPR. È importante notare che questa precisione è stata mantenuta su tutto il campo visivo a 53 × 53 μm², eccezionale per sistemi a base confocale.
Per dimostrare la capacità di imaging multicolore, Nup96, mitocondri e microtubuli nelle cellule U2OS sono stati marcati con DNA per l'acquisizione tramiteExchange-PAINT 18. Questa tecnica impiega filamenti ortogonali di DNA imager coniugati a un singolo fluoroforo, permettendo a tutti i bersagli di essere eccitati con la stessa sorgente laser (Figura 2A). Invece di acquisire segnali simultaneamente, li separa su round di imaging sequenziali, facilitando un'integrazione diretta in qualsiasi sistema commerciale SDC-OPR. La Figura 2B mostra Nup96 in blu etichettato con un nanocorpo anti-GFP, i mitocondri in rosso con un anticorpo anti-TOM20 secondario e i microtubuli in verde con un anticorpo primario anti-α-tubulina. In particolare, l'eccezionale precisione di localizzazione a singola molecola ottenuta per l'imaging Nup96 a colore singolo è stata preservata su tutti i target nell'esperimento multi-bersaglio, fornendo valori di precisione di localizzazione di 3,9 nm per il NPC, 4,0 nm per la α-tubulina e 3,3 nm per i mitocondri (Figura 2B pannelli 1, 2 e 3).
Per l'imaging di grande campo visivo, i microtubuli nelle celle HeLa venivano rimasti utilizzando vari ingrandimenti disponibili sul sistema SDC-OPR, combinati con diverse impostazioni di binning della fotocamera per mantenere dimensioni dei pixel tra 78 nm e 108 nm (Figura 3). La Figura 3A mostra il citoscheletro microtubulare di 10 cellule HeLa, con colori che rappresentano la precisione di localizzazione. A un ingrandimento di 1×, la precisione media della localizzazione è visibilmente inferiore rispetto a ingrandimenti più elevati (Figura 3B-D), con maggiore variabilità osservata. Ciò è dovuto alla riduzione della densità di potenza laser sul campo campo di visione più ampio, dove il profilo di illuminazione gaussiano diventa evidente, portando a una diminuzione della precisione verso i bordi del campo visivo. Tuttavia, raggiungere una precisione di localizzazione media di 9,5 nm su un ampio campo visivo di 211 × 211 μm² è impressionante per sistemi basati su confocali e consente un'indagine ad alta risoluzione sull'eterogeneità biologica.
Infine, la possibilità di richiamare cellule intere è dimostrata acquisendo immagini DNA-PAINT della rete di microtubuli in cellule HeLa fisse con un volume confocale di ~500 nm di spessore e 1 μm z-step utilizzando il massimo ingrandimento del sistema (FOV 4×, 53 × 53 μm²). La Figura 4A presenta le immagini di ricostruzione a singola molecola per ciascun piano z, insieme alla corrispondente precisione di localizzazione e ai valori di NeNA. Inoltre, una visualizzazione 3D a colori della rete di microtubuli nella cella HeLa è fornita nella Figura 4C. Con l'aumentare della profondità, il numero di fotoni rilevati diminuisce a causa della diffusione e delle aberrazioni ottiche, con conseguente riduzione della precisione di localizzazione sia per le precisioni di localizzazione derivate dal Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figura 4A, a destra) sia per quelle calcolate utilizzando la metrica NeNA. Tuttavia, l'elevato livello di raccolta dei fotoni possibile dal sistema SDC-OPR consente σSMLM ≤ 10 nm per una profondità di imaging fino a 9 μm con distribuzioni ristrette. Infatti, le strutture microtubulari filamentose a doppia parete erano chiaramente risolte a varie profondità: vicino all'interfaccia coverslip-cella, in posizioni assiali intermedie e nella parte superiore della cella, con distanza picco-picco tra 30 nm e 40 nm (Figura 4C), coerente con i valoririportati 24. Questi risultati evidenziano la capacità dell'SDC-OPR di fornire immagini ad alta risoluzione su ampi FOV e su tutta l'altezza delle cellule.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Microscopia di localizzazione a singola molecola in piano di diversi campioni cellulari e imaging multicolore a super-risoluzione. (A) Schema del sistema Spinning Disk Confocal con Optical Photon Reassignment (SDC-OPR), con un array di microlenti progettato per massimizzare la raccolta di fotoni. (B) Schema del DNA-PAINT: I filamenti di DNA marcati fluorescente, noti come filamenti di imager, si ibridano transitoriamente con sequenze di DNA complementari (filamenti di aggancio) che sono ancorati all'anticorpo/nanocorpo che prende di mira la proteina di interesse. Questi eventi di legame di breve durata generano segnali di fluorescenza che appaiono come lampeggiamenti stocastici. (C) Immagine rappresentativa DNA-PAINT sul sistema SDC-OPR utilizzando un ingrandimento di 4× del NPC delle celle U2OS. La capacità ad alta risoluzione è dimostrata nell'inset, dove i singoli NPC sono chiaramente risolti. (D) SDC-OPR-enhanced DNA-PAINT consente la visualizzazione di singoli NPC, dove frecce bianche evidenziano coppie di proteine caratteristiche Nup96 all'interno dell'architettura dei pori. (E) Distribuzione delle misurazioni di distanza tra i dimeri Nup96 (n=16 coppie) all'interno di singole unità di simmetria NPC. Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Exchange-PAINT per l'imaging multicolore utilizzando un microscopio SDC-OPR. (A) Schema di Exchange-PAINT di tre bersagli fotografici in sequenza. Tre bersagli proteici sono stati marcati con anticorpi funzionalizzati dal DNA, frammenti Fab o nanocorpi. I filamenti dell'imager Cy3B sono stati rimasti sequencialmente per tipo di filo, con passaggi di lavaggio tra i colpi di immagini. (B) Imaging a scambio tricolore (Exchange-PAINT) di cellule U2OS utilizzando microscopia SDC-OPR con ingrandimento 4×, mostrando microtubuli (rossi; etichettati con anti-α-tubulina coniugata con DNA), mitocondri (verdi; nanocorpi di DNA mirati a TOM20), e NPC (blu; Nup96 con marchio mEGFP e nanocorpi di DNA anti-GFP). Barra della scala: 5 μm. La regione zoomata enfatizza la risoluzione migliorata ottenuta dal sistema SDC-OPR, concentrandosi su (1) mitocondri, (2) microtubuli e (3) NUP. Barre di scala = 1 μm. Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Imaging DNA-PAINT all'interno di grandi FOV su un microscopio SDC-OPR. Immagini microtubulari DNA-PAINT (marcatura anti-α-tubulina) acquisite a ingrandimenti multipli: (A) ingrandimento 1× e 1 binning (FOV di 211 × 211 μm²), (B) binning 2,8× e 2 binning (FOV di 76 × 76 μm²), (C) ingrandimento 4× e 4 binning (FOV di 53 × 53 μm²). Il colore rappresenta la precisione di localizzazione da 0 a 16 nm nel caso di ingrandimento 1x e da 0 a 4 nm negli altri. (D) Precisione di localizzazione misurata a diverse distanze (in μm) dal centro del campo campo per ingrandimenti di 1× (rosso), 2,8× (giallo) e 4× (verde). Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imaging DNA a cellula intera - PAINT. (A) Sinistra. Imaging volumetrico dei microtubuli nelle cellule HeLa tramite DNA-PAINT acquisito tramite SDC-OPR a ingrandimento di 4×, mostrando sezioni assiali da z = 0 a 9 μm (passi di 1 μm). Ogni piano mostra la posizione z , la precisione di localizzazione e la metrica NeNA. Barre di scala: 5 μm (xy). Giusto. Precisione di localizzazione rispetto alla profondità di penetrazione per tutti i piani. (B) Rendering 3D della rete di microtubuli sulla stessa cella HeLa come in (A). Il colore rappresenta la profondità di penetrazione da 0 a 9 μm. (C) Immagini ingrandite di piccole regioni evidenziate da ciascuna profondità di penetrazione indicate in (A). Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Il nostro protocollo utilizza DNA-PAINT su un microscopio confocale a disco rotante con riassegnazione ottica dei fotoni per superare le limitazioni di profondità. DNA-PAINT ora raggiunge un livello di risoluzione estremamente elevato con multiplex e capacità quantitative, superando altre tecniche SMLM come PALM e STORM. Per cominciare, si utilizza un sistema confocale a disco rotante dotato di un'unità ottica di riassegnazione dei fotoni e di una fotocamera sCMOS.Avvia il sistema 30 minuti prima dell'imaging accendendo il microscopio, la macchina fotografica e i laser. Poi avvia il computer. Aspetta che il software NIS-Elements si carichi completamente.Ora, seleziona la modalità di imaging appropriata in NIS-Elements scegliendo SoRa Spinning Disk prima di impostare i parametri di acquisizione. Scegli l'obiettivo di immersione in olio con apertura numerica Apo 60x 1.49 per massimizzare la rilevazione di eventi a singola molecola. Poi, seleziona l'ingrandimento appropriato in base all'obiettivo, alle impostazioni della fotocamera e al campione.Regola la piegatura della fotocamera di conseguenza per corrispondere all'ingrandimento selezionato. Imposta il tempo di esposizione per l'acquisizione di DNA-PAINT. Ora, configura la lunghezza d'onda del laser, la potenza del laser e la ruota del filtro in base allo spettro dei coloranti dell'imager.Per registrare la potenza laser dopo l'obiettivo, posizionare un sensore calibrato di misuratore di potenza laser sul palco del microscopio vicino al piano del campione e registrare la potenza misurata. Successivamente, applica una goccia di olio a immersione sull'obiettivo dell'olio pulito con apertura numerica 60x Apo 1.49. Fissare il campione di cellula immunocolorata preparato sul palco del microscopio utilizzando un adattatore per ridurre al minimo la deriva.Passa alla modalità campo chiaro e concentrati sul piano vetroso usando le nanoparticelle come riferimento. Poi attiva il Sistema di Focus Perfetto per mantenere la messa a fuoco durante l'acquisizione. Con il Perfect Focus System attivo, si cambia temporaneamente l'eccitazione verso il canale proteico fluorescente verde per identificare il piano focale ottimale.Usa una bassa potenza laser durante questo passaggio. Definisci il nome dell'esperimento e il percorso di salvataggio. Spunta la casella del tempo per impostare intervallo, durata e numero di loop.Imposta l'intervallo su Nessun ritardo e inserisci il numero di loop corrispondenti al numero totale di fotogrammi. Assicurati che la scatola PFS in basso sia selezionata. Torna alle impostazioni di eccitazione SoRa precedentemente definite e premi Esegui ora.Acquisire da 15.000 a 20.000 frame per la prima proteina, utilizzando un tempo di integrazione di 300 millisecondi. Per l'analisi delle immagini, carichi la pila di immagini deconvolute nel modulo localizzato di Picasso. Seleziona Analizza e poi Parametri dalla barra del menu e inserisci i parametri specifici della fotocamera secondo le specifiche del produttore.Successivamente, imposta la lunghezza del lato della scatola a sette per ottimizzare la precisione di localizzazione di singola molecola. Scegli un valore minimo adatto del gradiente netto e abilita l'anteprima per visualizzare le localizzazioni rilevate. Regola la soglia di gradiente per minimizzare i rilevamenti di sfondo.Ora, seleziona Analizza e poi Localizza per iniziare l'identificazione e il fitting dei punti su tutti i frame. Carica l'hdf5 risultante nel modulo Picasso Render per visualizzare la mappa di localizzazione ricostruita. Scegli Postprocess e poi Undrift tramite RCC.Inserisci un valore di segmentazione iniziale a partire da 1.000 per ottenere un grafico di deriva xy. Ripeti con valori di segmentazione più bassi per migliorare la correzione della deriva. Clicca su File e Salva Localizzazione per salvare il file di localizzazione corretto per deriva prima di chiudere il modulo di rendering.Ora, carica il file corretto per deriva nel modulo Picasso Filter e applica soglie basate sulla precisione di localizzazione, larghezze delle funzioni di dispersione dei punti, conteggio dei fotoni e altre metriche di qualità. Clicca su File e salva localizzazione per salvare il file di localizzazione filtrato prima di chiudere il modulo filtro. L'imaging DNA-PAINT della nucleoporina 96 marcato con proteina fluorescente verde potenziata da monomerica nelle cellule U2OS ha prodotto un chiaro e super-risolto schema di complesso nucleare dei pori attraverso il campo visivo.Visualizzazioni zoomate hanno rivelato subunità accoppiate di nucleoporina 96 disposte con la simmetria attesa di otto volte dei pori nucleari. La misurazione della distanza euclidea tra coppie allineate di nucleoporine 96 ha mostrato una separazione picco-picco di 13 più o meno 2 nanometri. Nucleoporina 96, mitocondri e microtubuli sono stati visualizzati simultaneamente nelle cellule U2OS con una precisione di localizzazione a singola molecola preservata su tutti i bersagli.Ampio campo visivo L'imaging dei microtubuli nelle cellule HeLa ha dimostrato che la precisione di localizzazione variava con l'ingrandimento e la dimensione del campo, con una precisione ridotta osservata a ingrandimenti inferiori. Ingrandimenti più elevati producevano una precisione di localizzazione migliorata e più uniforme rispetto all'ingrandimento 1x. L'imaging a cellula intera è stato dimostrato tramite l'acquisizione da DNA-PAINT della rete di microtubuli su molteplici piani assiali che coprono tutta la profondità cellulare.La precisione di localizzazione diminuì gradualmente con l'aumento della profondità di immagigine. Le strutture microtubulari a doppia parete sono state risolte in più posizioni assiali con distanze picco-picco tra 30 e 40 nanometri. Il nostro protocollo consente immagini profonde di cellule e tessuti DNA-PAINT senza sacrificare la risoluzione, utilizzando ottiche semplici e commercialmente disponibili.Il DNA-PAINT ad alta risoluzione funziona principalmente sotto TIRF o alta illuminazione, limitando la profondità di imaging a pochi micron. I nostri risultati rendono DNA-PAINT accessibile a molti laboratori, consentendo l'imaging su scala nanometrica in cellule e tessuti in profondità.

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Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Si descrive come implementare fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione.

Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core

Le informazioni spazio-temporali sulle proteine dinamiche all'interno delle cellule vive sono fondamentali per comprendere la biologia. Un tipo di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata in 3D veloce (f3D-SIM) rivela informazioni uniche sull'anello Z citocinetico nei batteri: sia il suo aspetto simile a una perlina che la rapida dinamica di FtsZ all'interno dell'anello.

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Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

Questo articolo descrive un protocollo per l'individuazione di uno o più del plasma e/o proteine di membrana intracellulare mediante microscopia ad alta super-risoluzione stato fondamentale lo svuotamento (GSD) in cellule di mammifero. Andremo a discutere i vantaggi e le considerazioni di utilizzare tali approcci per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari.

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Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni (Video) | JoVE Journal

Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni

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