Sviluppo e standardizzazione di un micrometodo ex vivo per la quantificazione intracellulare della vincristina nelle cellule primarie ALL tramite LC-MS/MS

Il nostro obiettivo è misurare la vincristina intracellulare in campioni clinicamente rilevanti e indagare le interazioni tra le cellule farmacologiche. La sfida sperimentale attuale è ottimizzare il tempo di incubazione tra i vari modelli. Inoltre, l'accomodamento farmacologico dipendente da modello limita la robustezza, specialmente nei campioni primari di pazienti.

Per cominciare, scongelare il campione di cellula criopriservata facendo roteare delicatamente la fiala in un becher contenente 15 millilitri di acqua distillata a 37 gradi Celsius finché il contenuto non si scongela completamente. Trasferire il contenuto della fiala in un tubetto conico da 50 millilitri contenente 15 millilitri di PBS sterile 1X utilizzando una pipetta Pasteur sterile usa e getta. Metti il tubo nella centrifuga impostato a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, si scarta il surnatante invertendo il tubo con un unico movimento fluido. Ora, sospezione nuovamente il pellet cellulare con 10 millilitri di AIM V Medium usando una pipetta Pasteur usa e getta. Contare le cellule vitali utilizzando un contatore automatico e misurare la dimensione media delle cellule.

Calcola il volume necessario per ottenere 2,5 volte 10 alla potenza di sei celle vitali usando una proporzione semplice basata sulla concentrazione misurata della cella. Vortice la soluzione di vincristina ben prima dell'uso. Aggiungere AIM V Medium a un microtubo da due millilitri, seguito da 2,5 per 10 alla potenza di sei celle, e poi aggiungere il volume richiesto di soluzione di vincristina.

Vortice brevemente e fai girare il tubo per cinque secondi per raccogliere il liquido dal tappo. Successivamente, incubare i microtubi aperti a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore. Dopo l'incubazione, chiudere i coperchi dei tubi e centrifugare i campioni a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Scartare con attenzione il soprantantante usando una pipetta. Poi aggiungi un millilitro di PBS a temperatura ambiente al tubo. Dopo aver ripetuto i passaggi di centrifugazione e lavaggio, rimuovere con cura tutto il soprantantante residuo usando una pipetta.

risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS e vortice finché il pellet non è completamente sospeso. Ora, aggiungi 400 microlitri di metanolo freddo contenente 0,1 micromolari vinblastina a meno 20 gradi Celsius direttamente sul campione, evitando il contatto con le pareti del tubo. Conserva i campioni a meno 80 gradi Celsius durante la notte.

Preraffredda la centrifuga a quattro gradi Celsius prima di rimuovere i campioni dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Immediatamente dopo aver prelevato i campioni dal congelatore, centrifugali a 13.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Poi, trasferire 300 microlitri del sovrantantante in un microtubo da 1,5 millilitri usando una pipetta.

Asciuga completamente i campioni posizionandoli in un concentratore a vuoto impostato a 45 gradi Celsius per un'ora e 40 minuti. Dopo l'essiccazione, risospendere ogni pellet in 400 microlitri d'acqua contenente acido formico allo 0,1% utilizzando una pipetta. Vortice delicatamente finché il pellet non si dissolve completamente.

Ora, centrifuga di nuovo i campioni a 13.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 300 microlitri del sovrantante in una fiala a vite da due millilitri per l'analisi di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. Nella schermata principale del software, apri la lista dei campioni e crea una nuova lista inserendo i nomi dei campioni, i volumi di iniezione, le posizioni delle fiale e il metodo da utilizzare.

Inserire una fiala contenente acqua ultrapura nel vassoio dell'autocampionatore e designare questa fiala come uno spazio vuoto nella lista dei campioni. Fai una scansione tra ogni serie di iniezioni triplice per evitare il trasferimento. Seleziona le righe desiderate nella lista di esempio e inizia l'acquisizione dati cliccando su esegui e confermando con OK. Dopo il completamento, seleziona un campione dai risultati e visualizza i cromatogrammi cliccando su cromatogramma nella barra del menu in alto.

Infine, nella schermata principale, clicca sui link target. Seleziona i file appena eseguiti e clicca su processa. Seleziona il metodo vincristine e clicca su OK per generare le tabelle di output.

L'analisi cromatografica delle cellule xenoinnesti derivate da pazienti con leucemia linfoblastica acuta primaria, incubate con un micromolare vincristino per tre ore, ha mostrato costantemente un picco videoregistratore simmetrico e ben risolto a 2,85 minuti, confermando una ritenzione appropriata e una minima interferenza nella matrice. Le curve di calibrazione per la vincristina generate nei medi AIM V hanno mostrato una forte linearità tra concentrazioni da 0,001 a 10 micromolari. Analogamente, quando due volte 10 alla potenza di sei RS4; Sono state aggiunte 11 cellule, è stata osservata una risposta lineare da 0,01 a un micromolare.

L'analisi del corso temporale dell'accumulo di vincristina ha rivelato che RS4; 11 cellule hanno mostrato un plateau nel rapporto vincristina per vinblastina tra due e tre ore con un modesto aumento tra quattro e cinque ore, mentre le cellule primarie PDX hanno raggiunto il picco a due ore e sono diminuite successivamente, supportando la selezione di tre ore come tempo di incubazione bilanciato. L'accumulo normalizzato di vincristina variò su sei campioni di pazienti con PDX e fu osservata una correlazione positiva tra i rapporti non normalizzati di vincristina per vinblastina e il volume cellulare medio. L'analisi di frammentazione ha confermato che il picco di base della vincristina corrispondeva allo ione precursore al rapporto di carica principale 413,38, che generava uno ione di quantificazione a 392,47 e un ione di conferma a 383,38 sotto 40 volt di energia conica e 16 volt di energia di collisione.

Il nostro protocollo supera le limitazioni degli approcci indiretti consentendo una misurazione intracellulare diretta e sensibile dei farmaci principalmente nelle cellule leucemiche. Il nostro approccio facilita la misurazione diretta della vincristina intracellulare, anche se il numero di voti cellulari è basso. In futuro, indageremo se le differenze nell'accumulo intracellulare di farmaci siano associate alla resistenza in vitro ed esploreremo i meccanismi correlati.