Name: Sviluppo e standardizzazione di un micrometodo ex vivo per la quantificazione intracellulare della vincristina nelle cellule primarie ALL tramite LC-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Scopri il metodo LC-MS/MS per quantificare l'accumulo di vincristina nelle cellule primarie pediatriche di leucemia linfoblastica acuta. Questo protocollo ottimizzato migliora il monitoraggio terapeutico clinico.

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<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Fiala a vite da 2,0 mL</td><td>Flusso di alimentazione</td><td>8-2400</td><td>Utilizzato con inserti in vetro con molla (5 x 29 mm) della stessa azienda (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Fiala a vite da 2,0 mL</td><td>Flusso di alimentazione</td><td>8-2400</td><td>Utilizzato con inserti in vetro con molla (5 x 29 mm) della stessa azienda (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>AIM V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>Sistema cromatografico Acquity UPLC H-Class</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>Contessa 3 FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di vetro</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>Fisher Scientific</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>Il software per l'acquisizione dati</td><td>Waters Co.</td><td>MassLynx</td><td></td></tr><tr><td>Triplo spettrometro di massa quadrupolo Xevo TQ-S micro</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore a Ultrasuoni</td><td>Quimis</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>Vinblastina 1 mg/mL</td><td>Libbs</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>Vinblastina solfato</td></tr><tr><td>Vincristine</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo e standardizzazione di un micrometodo ex vivo per la quantificazione intracellulare della vincristina nelle cellule primarie all tramite lc-ms/ms

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

I risultati cromatografici rappresentativi ottenuti dopo saggi di accumulo intracellulare utilizzando cellule primarie ALL PDX incubate con VCR e VINB sono mostrati nella Figura 1. I campioni sono stati preparati utilizzando 2,5 × 106 celle per ogni condizione. Nelle condizioni cromatografiche descritte, il videoregistratore è stato costantemente mantenuto a 2,85 minuti con un effetto matrice minimo, e la forma di picco è stata simmetrica e ben risolta. Questi profili illustrano i...

Sviluppo e standardizzazione di un micrometodo ex vivo per la quantificazione intracellulare della vincristina nelle cellule primarie ALL tramite LC-MS/MS

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

Il nostro obiettivo è misurare la vincristina intracellulare in campioni clinicamente rilevanti e indagare le interazioni tra le cellule farmacologiche. La sfida sperimentale attuale è ottimizzare il tempo di incubazione tra i vari modelli. Inoltre, l'accomodamento farmacologico dipendente da modello limita la robustezza, specialmente nei campioni primari di pazienti.Per cominciare, scongelare il campione di cellula criopriservata facendo roteare delicatamente la fiala in un becher contenente 15 millilitri di acqua distillata a 37 gradi Celsius finché il contenuto non si scongela completamente. Trasferire il contenuto della fiala in un tubetto conico da 50 millilitri contenente 15 millilitri di PBS sterile 1X utilizzando una pipetta Pasteur sterile usa e getta. Metti il tubo nella centrifuga impostato a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, si scarta il surnatante invertendo il tubo con un unico movimento fluido. Ora, sospezione nuovamente il pellet cellulare con 10 millilitri di AIM V Medium usando una pipetta Pasteur usa e getta. Contare le cellule vitali utilizzando un contatore automatico e misurare la dimensione media delle cellule.Calcola il volume necessario per ottenere 2,5 volte 10 alla potenza di sei celle vitali usando una proporzione semplice basata sulla concentrazione misurata della cella. Vortice la soluzione di vincristina ben prima dell'uso. Aggiungere AIM V Medium a un microtubo da due millilitri, seguito da 2,5 per 10 alla potenza di sei celle, e poi aggiungere il volume richiesto di soluzione di vincristina.Vortice brevemente e fai girare il tubo per cinque secondi per raccogliere il liquido dal tappo. Successivamente, incubare i microtubi aperti a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore. Dopo l'incubazione, chiudere i coperchi dei tubi e centrifugare i campioni a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.Scartare con attenzione il soprantantante usando una pipetta. Poi aggiungi un millilitro di PBS a temperatura ambiente al tubo. Dopo aver ripetuto i passaggi di centrifugazione e lavaggio, rimuovere con cura tutto il soprantantante residuo usando una pipetta.risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS e vortice finché il pellet non è completamente sospeso. Ora, aggiungi 400 microlitri di metanolo freddo contenente 0,1 micromolari vinblastina a meno 20 gradi Celsius direttamente sul campione, evitando il contatto con le pareti del tubo. Conserva i campioni a meno 80 gradi Celsius durante la notte.Preraffredda la centrifuga a quattro gradi Celsius prima di rimuovere i campioni dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Immediatamente dopo aver prelevato i campioni dal congelatore, centrifugali a 13.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Poi, trasferire 300 microlitri del sovrantantante in un microtubo da 1,5 millilitri usando una pipetta.Asciuga completamente i campioni posizionandoli in un concentratore a vuoto impostato a 45 gradi Celsius per un'ora e 40 minuti. Dopo l'essiccazione, risospendere ogni pellet in 400 microlitri d'acqua contenente acido formico allo 0,1% utilizzando una pipetta. Vortice delicatamente finché il pellet non si dissolve completamente.Ora, centrifuga di nuovo i campioni a 13.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 300 microlitri del sovrantante in una fiala a vite da due millilitri per l'analisi di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. Nella schermata principale del software, apri la lista dei campioni e crea una nuova lista inserendo i nomi dei campioni, i volumi di iniezione, le posizioni delle fiale e il metodo da utilizzare.Inserire una fiala contenente acqua ultrapura nel vassoio dell'autocampionatore e designare questa fiala come uno spazio vuoto nella lista dei campioni. Fai una scansione tra ogni serie di iniezioni triplice per evitare il trasferimento. Seleziona le righe desiderate nella lista di esempio e inizia l'acquisizione dati cliccando su esegui e confermando con OK. Dopo il completamento, seleziona un campione dai risultati e visualizza i cromatogrammi cliccando su cromatogramma nella barra del menu in alto.Infine, nella schermata principale, clicca sui link target. Seleziona i file appena eseguiti e clicca su processa. Seleziona il metodo vincristine e clicca su OK per generare le tabelle di output.L'analisi cromatografica delle cellule xenoinnesti derivate da pazienti con leucemia linfoblastica acuta primaria, incubate con un micromolare vincristino per tre ore, ha mostrato costantemente un picco videoregistratore simmetrico e ben risolto a 2,85 minuti, confermando una ritenzione appropriata e una minima interferenza nella matrice. Le curve di calibrazione per la vincristina generate nei medi AIM V hanno mostrato una forte linearità tra concentrazioni da 0,001 a 10 micromolari. Analogamente, quando due volte 10 alla potenza di sei RS4; Sono state aggiunte 11 cellule, è stata osservata una risposta lineare da 0,01 a un micromolare.L'analisi del corso temporale dell'accumulo di vincristina ha rivelato che RS4; 11 cellule hanno mostrato un plateau nel rapporto vincristina per vinblastina tra due e tre ore con un modesto aumento tra quattro e cinque ore, mentre le cellule primarie PDX hanno raggiunto il picco a due ore e sono diminuite successivamente, supportando la selezione di tre ore come tempo di incubazione bilanciato. L'accumulo normalizzato di vincristina variò su sei campioni di pazienti con PDX e fu osservata una correlazione positiva tra i rapporti non normalizzati di vincristina per vinblastina e il volume cellulare medio. L'analisi di frammentazione ha confermato che il picco di base della vincristina corrispondeva allo ione precursore al rapporto di carica principale 413,38, che generava uno ione di quantificazione a 392,47 e un ione di conferma a 383,38 sotto 40 volt di energia conica e 16 volt di energia di collisione.Il nostro protocollo supera le limitazioni degli approcci indiretti consentendo una misurazione intracellulare diretta e sensibile dei farmaci principalmente nelle cellule leucemiche. Il nostro approccio facilita la misurazione diretta della vincristina intracellulare, anche se il numero di voti cellulari è basso. In futuro, indageremo se le differenze nell'accumulo intracellulare di farmaci siano associate alla resistenza in vitro ed esploreremo i meccanismi correlati.

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Si descrive un metodo per l'inseguimento della rottura endomembrane suscitato dai batteri...

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l'applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.

Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di<em&gt; In Vitro</em&gt; colture cellulari

Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Qui, presentiamo un protocollo per etichettare le vescicole extracellulari derivate dal lisato piastrinico per monitorare la loro migrazione e assorbimento negli espianti di cartilagine utilizzati come modello per l'osteoartrite.

Etichettatura delle vescicole extracellulari per il monitoraggio della migrazione e dell'assorbimento negli espianti di cartilagine

Questo manoscritto descrive come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dalle cellule tumorali (EV) utilizzando la citometria a flusso. Gli EV derivati da tumori sottoposti a morte cellulare immunogenica indotta dal trattamento sembrano particolarmente rilevanti nell'immunosorveglianza tumorale. Questo protocollo esemplifica la valutazione dei veicoli elettrici immunostimolatori del tumore indotti da oxaliplatino, ma può essere adattato a varie impostazioni.

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Le vescicole extracellulari (EV) contribuiscono alla biologia cellulare e alle comunicazioni intercellulari. C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento dei veicoli elettrici da parte delle cellule. L'attuale protocollo propone il test di assorbimento EV utilizzando l'imaging tridimensionale a fluorescenza tramite microscopia confocale, dopo l'isolamento EV da un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione.

Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale

Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.

Metabolomica mirata su cellule primarie rare

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Scopri il metodo LC-MS/MS per quantificare l'accumulo di vincristina nelle cellule primarie pediatriche di leucemia linfoblastica acuta. Questo protocollo ottimizzato migliora il monitoraggio terapeutico clinico.

Sviluppo e standardizzazione di un micrometodo ex vivo per la quantificazione intracellulare della vincristina nelle cellule primarie ALL tramite LC-MS/MS (Video) | JoVE Journal

Sviluppo e standardizzazione di un micrometodo ex vivo per la quantificazione intracellulare della vincristina nelle cellule primarie ALL tramite LC-MS/MS

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