Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi
10 aprile 2026
Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.
Studiamo lo sviluppo del pancreas endocrino umano utilizzando occhiali derivati dalle cellule staminali per comprendere la base genetica del diabete. Il trapianto tradizionale di capsule renali è altamente invasivo. Il protocollo di trapianto intramuscolare offre un'alternativa più semplice, riproducibile e minimamente invasiva.
Per cominciare, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione antiaderente al 5% per coprire il fondo di una piastra micropozzo a 24 pozzi contenenti micropozzi piramidali invertiti. Centrifuga la piastra a 1.300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Poi esamina i micropozzi al microscopio per trovare bolle d'aria.
Dopo aver ricentrifugato la placca, per rimuovere l'aria intrappolata, aspirare la soluzione antiaderente. Poi lava ogni pozzo con 0,5 millilitri di PBS e ripeti ancora una volta il passaggio di lavaggio. Successivamente, lavare i progenitori pancreatici coltivati sviluppati dagli hPSC con un millilitro di PBS con 0,5 millimolari di EDTA.
Aspirare il PBS con 0,5 millimolari di EDTA e coprire i pozzi con tripsina. Poi incubare a 37 gradi Celsius per otto a dodici minuti. Diluire la tripsina con due volumi di DMEM/F12 o PBS e risospendere delicatamente le cellule tramite pipetta.
Trasferisci la sospensione in un tubo conico e procedi immediatamente al passaggio successivo. Centrifuga la sospensione a 200 g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il sovrandanante e ri-sospendere delicatamente il pellet in un mezzo S4 preriscaldato.
Poi, aspira il PBS dalle piattole micropozzi. Aggiungi delicatamente 1,25 millilitri delle celle sospese in ciascun pozzo della piastra del micropozzo. Centrifugare la piastra a 100 g per tre minuti a temperatura ambiente per distribuire uniformmente le celle nei micropozzi.
Trasferire con attenzione la piastra micropozzo in un incubatore umidificato. Per effettuare modifiche al mezzo con il mezzo di differenziazione, aspirare delicatamente e dispensare il mezzo lungo le pareti del pozzo per prevenire turbolenza e lo spostamento di cluster cellulari dai micropozzi. Dopo aver trasferito la quantità appropriata di grappoli generati in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, collegare la siringa al tubo dell'ago e riempirlo con mezzo S7.
Aspira i cluster direttamente nel tubo dalla microcentrifuga. Piega il tubo a metà e inserisci la sezione piegata in una punta di pipetta da 200 microlitri. Poi inserisci il tubo della punta in un tubo conico da 15 millilitri e fissa le estremità al bordo del tubo usando del nastro adesivo.
Centrifugare il tubo a 100 g per due minuti a 4 gradi Celsius per compattare i gruppi e posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Per trapiantar i grappoli nei topi gamma NOD scid anestetizzati, radere la parte mediale della gamba destra sotto il ginocchio e disinfettare con il 70% di etanolo. Poi stacca il tubo dalla punta della pipetta e collegalo alla siringa.
Taglia il tubo vicino ai grappoli compattati e fissalo all'estremità smussata dell'ago. Spingi la soluzione salina finché il primo grappolo non raggiunge la punta dell'ago. Poi posiziona il topo a terra, inclinandolo verso destra e estendendo la gamba destra.
Inserire l'ago da quattro a cinque millimetri di profondità nel compartimento mediale della coscia destra tra i muscoli adduttore e gracile. Poi inietta i cluster mentre si ritrae l'ago di circa tre millimetri. Ruota la siringa, ritira l'ago e lascia che il topo si riprenda.
Dopo il recupero del trapianto sei settimane dopo il trapianto e la sezionazione del tessuto, eseguire immunocolorazioni per consentire ulteriori analisi di imaging. Le sospensioni a singola cellula dei progenitori pancreatici di stadio quattro sono state inserite in piastre micropozzo per generare aggregati tridimensionali controllati dalla dimensione. Nel giro di 24-48 ore si formarono compatti ammassi sferici.
La microscopia a fluorescenza ha confermato la presenza di cellule PDX1 ed esprimenti insulina nelle linee hPSC reporter. Dopo sei settimane, il sito dell'innesto è stato visualizzato macroscopicamente con masse simili a occhietti identificabili all'interno del muscolo. Dopo l'escissione, gli espiantili furono identificati al microscopio stereo come pallide strutture sferiche di legami.
È stata osservata una rilevazione robusta di cellule C-peptide positive negli animali trapiantati. La colorazione con insulina ha confermato la presenza di cellule umane simili a beta all'interno dell'innesto. Sono state rilevate cellule positive a glucagon e somatostatina, indicando la conservazione delle popolazioni di cellule alfa e delta.
Questo protocollo facilita i test funzionali in vivo e la valutazione della sopravvivenza e maturazione dei trapianti umani trapiantati. La considerazione più importante è garantire una differenziazione delle cellule staminali di alta qualità e una gestione delicata delle cellule durante la formazione dei cluster per massimizzare la vitalità e garantire una buona sopravvivenza cellulare. Questi modelli facilitano l'interrogazione dei meccanismi genetici alla base del diabete monogenico e della disfunzione delle cellule beta.
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Panoramica
Questo articolo di JoVE presenta un protocollo dettagliato per il trapianto intramuscolare di SC-îlots pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in topi immunodeficienti. Il metodo offre un'alternativa meno invasiva rispetto al trapianto sotto la capsula renale o sottocutaneo, consentendo un accesso chirurgico semplice e un recupero affidabile dell'innesto. Il protocollo permette la valutazione della funzione degli îlots mediante secrezione insulinica stimolata dal glucosio (GSIS) in vivo dopo una sfida orale con glucosio e facilita l'analisi istologica successiva.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Medicina rigenerativa
- Terapia con cellule staminali
- Ricerca sul diabete
Sfondo
- Le cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane offrono prospettive promettenti per la terapia cellulare del diabete e la modellizzazione delle malattie.
- Attuali siti di trapianto come la capsula renale o lo spazio sottocutaneo presentano limitazioni tecniche o fisiologiche.
- Spesso è necessario un impianto in vivo per studiare la maturazione e la funzione degli isolotti derivati da cellule staminali in un contesto fisiologico.
- È necessario disporre di siti di trapianto riproducibili e accessibili che consentano il recupero dell'innesto e la valutazione della funzionalità.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per il trapianto intramuscolare di SC-isolotti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in topi immunodeficienti.
- Consentire la valutazione dell'innesto, della sopravvivenza e della funzionalità degli isolotti in un sito minimamente invasivo.
- Supportare la valutazione funzionale mediante GSIS in vivo e analisi istologica post-trapianto.
- Stabilire un quadro riproducibile per la ricerca preclinica sul diabete mediante l'uso di isolotti derivati da cellule staminali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione e compattazione di aggregati pancreatici SC-insulari derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC).
- Chirurgia di trapianto intramuscolare in topi immunodeficienti.
- Valutazione della secrezione in vivo di insulina stimolata da glucosio (GSIS) dopo somministrazione orale di glucosio.
- Recupero dell'innesto e analisi istologica per la valutazione post-trapianto.
Risultati principali
- Attecchimento e sopravvivenza riusciti di isolotti derivati da hPSC nel sito di trapianto intramuscolare.
- Rilevamento di una secrezione insulinica funzionale in risposta a stimolo glucidico mediante GSIS in vivo.
- Recupero affidabile degli innesti per l'analisi istologica, che conferma la struttura degli isolotti e l'espressione dei marcatori.
- Dimostrazione di un metodo riproducibile e minimamente invasivo per studi preclinici di trapianto di isolotti.
Conclusioni
- Il trapianto intramuscolare è un sito praticabile e accessibile per l'attecchimento di isolotti derivati da hPSC nei topi.
- La procedura consente la valutazione funzionale di isolotti derivati da cellule staminali mediante GSIS in vivo.
- Il recupero dell'innesto permette un'analisi istologica e molecolare completa dopo il trapianto.
- Questo protocollo fornisce un modello preclinico riproducibile per promuovere la ricerca sulle terapie cellulari del diabete.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane fornisce un modello preclinico riproducibile e poco invasivo per lo sviluppo della terapia cellulare del diabete. Questo approccio consente la valutazione funzionale delle isole derivate da cellule staminali mediante secrezione di insulina stimolata dal glucosio in vivo e permette un recupero affidabile degli innesti per analisi successive, superando limitazioni fondamentali dei siti di trapianto tradizionali. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva della valutazione preclinica offrendo un contesto fisiologico per la maturazione e la funzionalità delle isole, migliorando al contempo l'accessibilità chirurgica e riducendo l'invasività sugli animali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche valutando la maturazione funzionale di isolotti derivati da cellule staminali in un contesto fisiologico.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante un'attecchimento affidabile e una secrezione di insulina responsiva al glucosio in topi immunodeficienti.
- Valore strategico: Favorisce una previsione affidabile nella validazione del bersaglio fornendo letture funzionali riproducibili prima dell'ottimizzazione del composto leader.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo l'innesto funzionale delle isole.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di trapianto per garantire riproducibilità e scalabilità negli studi preclinici.
- Valore strategico: Migliora la prontezza del saggio consentendo uscite funzionali quantitative mediante GSIS in vivo per la valutazione dell'effetto dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia modellando la funzione degli isolotti umani in vivo, sostenendo l'allineamento dei biomarcatori traslazionali.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, grazie al recupero costante degli innesti e all'analisi istologica.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio fornendo dati funzionali e strutturali sull'innesto e la maturazione degli isolotti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel processo di scoperta supportando la verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta, consentendo la standardizzazione dei saggi per lo screening e fornendo letture funzionali che guidano le decisioni relative all'identificazione dei composti promettenti e al loro sviluppo preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi valutando la funzione degli isolotti in un sito di trapianto fisiologico.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio attraverso un trapianto standardizzato e misurazioni riproducibili della secrezione di insulina stimolata dal glucosio.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti mediante GSIS in vivo per confrontare la funzione del trapianto in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica consentendo l'analisi istologica e molecolare dei trapianti recuperati per la valutazione della maturazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma preclinica riutilizzabile per cicli iterativi di progettazione e verifica nello sviluppo di terapie per il diabete basate su cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella funzionalità e nella maturazione degli isolotti derivati da cellule staminali.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità delle procedure di trapianto tra diversi centri di ricerca.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati funzionali affidabili, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi sul diabete.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta rispetto al rischio attraverso la valutazione riproducibile dell'attecchimento e della funzionalità degli isolotti derivati da cellule staminali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella differenziazione delle cellule staminali, nelle tecniche di trapianto microchirurgico e nei test metabolici in vivo.
- Dipende da infrastrutture chirurgiche sterili, sistemi per la sfida al glucosio e saggi di rilevamento dell'insulina per ottenere letture funzionali.
- Necessita di una standardizzazione tra team diversi, tra quelli preposti all'elaborazione cellulare, alla chirurgia e all'analisi, per garantire risultati costanti.
- Comporta considerazioni di adattamento relative a diverse linee di topi immunodeficienti e ai tempi di maturazione degli isolotti.
- È limitato dalla necessità di monitoraggio postoperatorio e di procedure di recupero del trapianto, che potrebbero influire sulla produttività in studi su larga scala.
