Imaging a due fotoni intravitali della morfologia degli assoni sensoriali del tatto nella pelle del topo

Stiamo indagando i meccanismi molecolari e cellulari della formazione del circuito somatosensoriale tramite imaging in vivo degli assoni somatosensoriali nella pelle del topo. Gli sviluppi recenti nella genetica dei topi per la ricerca sulla sensazione somatosensoriale ci hanno permesso di studiare lo sviluppo assonico somatosensoriale in vivo con specificità di sottotipo. Per cominciare, accendi il laser e lascia il tempo necessario per riscaldarsi.

Poi, accendi il microscopio a due fotoni e apri il software di controllo e acquisizione sul computer collegato. Accendi la borsa termica e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia durante l'anestesia. Ora, trasferisci il mouse anestetizzato sulla borsa riscaldante sulla piattaforma di imaging.

Allinea il corpo del topo su una piattaforma adiacente al palco di imaging in modo che non tocchi l'area dove è montata la zampa, minimizzando gli artefatti di movimento durante l'imaging. Ora, applica una pomata oftalmica su entrambi gli occhi del topo per evitare la secchezza durante l'imaging. Poi, usando un cotton fioc, applica delicatamente una crema depilatoria sulla zampa del topo per rimuovere i peli.

Dopo un minuto, togli la panna e pulisci la zampa usando etanolo al 70% seguito dall'acqua. Poi, con una mano, allunga delicatamente la pelle per stabilizzare la superficie della zampa. Utilizzando un ago sterile calibro 30 e inchiostro nero, perforare la pelle e tatuare due punti adiacenti ai lati della regione di imaging bersaglio, distanziati a circa due millimetri di distanzia.

Dopo il tatuaggio, getta l'ago usato in un contenitore per oggetti taglienti. Prendi un vetrino di vetro per microscopio e posiziona quattro puntini di grasso a vuoto agli angoli. Poi, posiziona un pezzo di argilla spesso un millimetro al centro della lastra.

Metti il carrello sotto la lente dell'obiettivo e centra la zampa del topo direttamente sopra l'argilla. Fai rotolare delicatamente la zampa del topo sul slide per appiattirla e premetterala contro l'argilla. Poi, posiziona con cura un copricapo da 22 per 60 millimetri sopra la zampa per fissarla.

Regolare l'angolo della pelle del topo applicando una leggera pressione su ogni angolo dello slittamento del coperchio finché la superficie della pelle non è parallela al piano di immagini. Per visualizzare la pelle glabra, usa una pinzetta per ruotare la zampa, così che la pelle glabra sia rivolta verso l'alto, e poi usa l'estremità piatta della pinzetta per premere delicatamente la zampa contro l'argilla. Una volta appiattito, posiziona il copricapo sopra e premi con attenzione.

Conferma che la zampa sia centrata. Posiziona una goccia di acqua distillata sul sottovoglio di copertura direttamente sopra la zampa del topo. Abbassa l'obiettivo finché non si forma una colonna d'acqua tra l'obiettivo e il sveglino di copertura.

Una volta che la lente dell'obiettivo è centrata sopra la zampa del topo, chiudi la scatola del microscopio e usa lo schermo LED per mettere a fuoco il campione regolando i controller X, Y e Z. Lo schermo LED mostrerà un'immagine in tempo reale illuminata dai microscopi a LED integrati. Dopo aver individuato il campione, spegni lo schermo LED.

Per iniziare l'imaging a due fotoni, ruota la leva sul lato destro in alto del microscopio per passare dalla modalità specchio a quella dicroica. Poi, chiudi le tende oscuranti e accendi il rivelatore per visualizzare la proteina fluorescente gialla, o YFP. In vista prairie, apri l'otturatore e passa il software in modalità imaging.

Per l'imaging thy1-YFP, accendi il laser sintonizzabile e imposta la lunghezza d'onda a 960 nanometri, con un guadagno tra 700 e 800. Per l'imaging della proteina fluorescente verde, o GFP, regola il laser a 920 nanometri. Per i topi di età postnatale al decimo giorno o meno, imposta la potenza laser iniziale a 50 e aumenta gradualmente la potenza fino a raggiungere l'intensità del segnale desiderata.

Questo riduce al minimo la penetrazione della luce e riduce il rischio di danni fotografici. Una volta impostata la lunghezza d'onda del laser, il guadagno e la potenza, inizia a scansionare il tessuto. Ora, usa i controller X, Y e Z per localizzare il campo di imaging e regolare lo zoom se necessario.

Inizia l'acquisizione dell'immagine in una posizione circa 10-20 micrometri sotto la superficie cutanea. Infine, rimuovere la zampa del topo dal vetrino di vetro dopo l'imaging e riportare il topo in una gabbia di recupero per le cure post-operatorie. Nella pelle pelosa dei topi adulti, l'organizzazione terminale assonale complessiva nelle quattro zampe è stata rivelata tramite una proiezione di massima intensità, mostrando terminazioni lanceolate completamente sviluppate che circondano i follicoli piliferi.

La densità media delle terminazioni lanceolate che circondano i follicoli piliferi in questi topi era di 15,8 terminazioni per millimetro quadrato. Al quarto giorno postnatale, è stata osservata un'estremità lanceolata delta A a rada e a forma di mezzaluna che innervava un follicolo pilifero. Un complesso lanceolato longitudinale in pelle pelusa è stato fotografato in un topo adulto al 39° giorno postnatale, e immagini ad alta risoluzione del piano Z hanno mostrato l'individuo A beta che si adattava rapidamente alle terminazioni lanceolate LTMR, ciascuna separata da tre micrometri.

Complessi lanceolati immaturi sono stati osservati nella pelle pelosa al decimo giorno postnatale con meno assoni LTMR A beta, e i singoli piani Z hanno mostrato scarse terminazioni lanceolate nascenti. Nella punta del dito adulto del topo, sono stati visualizzati assoni A beta RA LTMR mentre innervavano i corpuscoli di Meissner come strutture ellissoide sotto l'epidermide e le singole sezioni ottiche mettono in evidenza terminali assonici discreti a diverse profondità della pelle. In tre giorni consecutivi, gli stessi fasci nervosi nella pelle pelosa del topo adulto sono stati identificati con lievi variazioni di forma, probabilmente dovute alla posizione delle zampe.

Le stesse morfologie assonali intorno ai follicoli piliferi nella pelle pilusa sono state sistemate in tre giorni. Il nostro protocollo affronta una sfida sul campo: visualizzare la struttura e la dinamica assonica somatosensoriale negli animali viventi durante lo sviluppo. La nostra tecnica consente l'imaging cronico ad alta risoluzione dello sviluppo degli assoni somatosensoriali e anche in stadio adulto in vivo.

Questo studio consente di indagare i meccanismi molecolari e cellulari dello sviluppo e della rigenerazione assonica somatosensoriale in vivo.