Procedure per l'identificazione degli inibitori dell'ingresso del SARS-CoV-2 come potenziali antivirali utilizzando pseudovirus basati su MLV

La nostra ricerca si concentra sull'identificazione di inibitori che bloccano l'ingresso del SARS-CoV-2 tramite sistemi pseudovirali. Lo studio dell'ingresso nel SARS-CoV-2 richiede spesso laboratori di contenimento di biosicurezza elevati, tipicamente BSL-3. Questo protocollo consente uno screening antivirale sicuro utilizzato nei pseudovirus in laboratori BSL-2 standard.

Per cominciare, posizionare una piastra di coltura tissutale a sei pozzi nell'armadietto di biosicurezza e seminare 7,5 per 10 alla potenza di cinque cellule derivate da HEK 293 per pozzo in due millilitri di mezzo completo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% durante la notte. Il giorno seguente, confermare che le cellule hanno raggiunto circa il 50-60% di confluenza.

Il giorno successivo, prepara la soluzione di polietilenimina o PEI aggiungendo cinque microlitri di un milligrammo per millilitro di stock PEI a 50 microlitri di mezzo siero ridotto in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. In un tubo microcentrifuga separato da 1,5 millilitri, preparare la soluzione di DNA aggiungendo 2,5 microgrammi di plasmide che esprime GFP a 50 microlitri dello stesso mezzo. Mescola brevemente ogni tubo vortizzando, poi gira giù per cinque secondi e incuba a temperatura ambiente.

Durante il periodo di incubazione di 10 minuti, rimuovere con cura il mezzo da ogni pozzetto della piastra a sei pozzi senza disturbare il monostrato cellulare e aggiungere un millilitro di mezzo per la transfezione completo privo di antibiotici in ciascun pozzo. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri della soluzione di DNA al tubo contenente la soluzione PEI. Mescola rapidamente pipettando sei volte e incuba a temperatura ambiente per esattamente tre minuti.

Poi aggiungi rapidamente il complesso di DNA PEI a goccia nel pozzo corrispondente. Ora, sigilla i bordi della piastra con parafilm e centrifuga a 1000 G per 30 minuti a temperatura ambiente senza interruzioni, usando un rotore oscillante e un secchio per piastre. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente il parafilm e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore.

Poi sostituisci delicatamente il mezzo di trasfezione in ogni pozzo con due millilitri di mezzo DMEM completo preriscaldato. Incubare le cellule trasfectate a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 48 ore e valutare l'efficienza della trasfezione valutando l'espressione di GFP tramite microscopia a fluorescenza. Il seme HEK 293T ha derivato le celle in due piastre a 6 pozzi come dimostrato in precedenza.

Designa una piastra per la generazione di pseudo-virus di spike SARS-CoV-2 e l'altra per i pseudovirus VSVG. Prepara il mix di trasfezione e i complessi di DNA PEI il giorno dell'esperimento e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, rimuovere con cura il mezzo da ciascun pozzo delle sei piastre senza disturbare il monostrato cellulare.

Aggiungi lentamente un millilitro di mezzo di trasfezione completa preriscaldato senza antibiotici in ogni pozzo, permettendo al mezzo di scorrere lungo la parete del pozzo. Aggiungi i complessi di trasfezione preparati alle cellule per trasfettare come dimostrato in precedenza. Dopo 48 ore di incubazione post-trasfezione, raccogli i soprannatanti da ciascun pozzo in un tubo centrifuga conico sterile da 50 millilitri e centrifuga a 290 G per sette minuti a quattro gradi Celsius.

Raccogli il surnadante senza cellule e filtralo attraverso un'unità di filtro sterile in polivinilidene fluoruro da 0,45 micrometri. Preparare aliquote di un millilitro del surnante filtrato e conservarle a meno 80 gradi Celsius Seed 2,5 per 10 alla potenza di quattro celle HSI, una linea cellulare altamente suscettibile al SARS-CoV-2, in 50 microlitri di DMEM completo per pozzo in una piastra di coltura tessutale da 96 pozzi. Prepara e etichetta i pozzi triplicati per ogni condizione da testare, inclusi i virus senza scintilla e i controlli non infetti.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% durante la notte. Il giorno della trasduzione, scongelare un'aliquota di ogni lotto di pseudo virus sul ghiaccio e mescolare delicatamente per inversione, includendo un'aliquota del controllo senza spine. Aggiungi i volumi necessari di preparazione pseudo-virale direttamente ai pozzi designati.

Regola il volume di ogni pozzo a 150 microlitri con DMEM completo. Ora, sigilla la piastra con parafilm e centrifuga a 2.500 G per 45 minuti a temperatura ambiente senza interruzioni. Rimuovere il sigillo del parafilm e incubare la piastra per 72 ore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.

Dopo l'incubazione, prepara i reagenti per il test di luciferasi secondo le istruzioni del produttore. Scongelare il substrato della luciferasi e il tampone di lisi per il saggio luciferasi 5X a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Diluire il tampone di lisi 5X del test luciferasi a 1X con acqua sterile.

Aspira con cura e scarta il soprantantante. Successivamente, aggiungi 30 microlitri di 1X lysis buffer in ciascun pozzo. Posiziona il piatto su uno shaker e agita per 10 minuti a 150 giri al minuto a temperatura ambiente.

Verifica la lisi cellulare completa al microscopio rovesciato per confermare che le cellule siano completamente lisate e non distinguibili. Poi trasferisci i lisati su una piastra bianca opaca a 96 pozzi. Aggiungi 50 microlitri di substrato di luciferasi in ogni pozzo.

Mescola brevemente muovendo delicatamente la piastra in un movimento circolare e posiziona la piastra nel luminometro per misurare la luminescenza. Seed 2,5 per 10 alla potenza di quattro celle HSI in 50 microlitri di DMEM completo per pozzo in una piastra da 96 pozzi come descritto in precedenza. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.

Il giorno successivo si prepara da una a tre diluizioni seriali dei composti da testare, come l'arbidolo in DMEM completo contenente 0,5% di dimetil solfosdo. Utilizzando una pipetta multicanale, aspira delicatamente il mezzo da ogni pozzo. Aggiungere 50 microlitri della corrispondente diluizione composta a ciascun pozzo aggiungendo il DMEM completo da solo ai pozzi di controllo della colonna 12.

Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Senza rimuovere i composti, aggiungere direttamente 50 microlitri di pseudo-virus SARS-CoV-2 spike a ciascun pozzo diluito in un mezzo completo contenente le stesse concentrazioni composte. Sigilla la piastra con parfilm.

Centrifuga a 2.500 G per 45 minuti a temperatura ambiente senza interruzioni. Dopo aver rimosso la parfilm, incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 72 ore. Infine, quantificare l'infettività utilizzando un saggio sulla luciferasi come dimostrato in precedenza.

La trasfezione di cellule derivate da HEK 293T con PEI ramificata ha portato a un'elevata efficienza di trasfezione, risultando circa al 70% di cellule positive per la GFP. 48 ore dopo la trasfezione. L'infezione di cellule HSI suscettibili con quantità decrescenti di pseudovirus spike SARS-CoV-2 o pseudo virus VSVG ha mostrato un aumento della luminescenza dipendente dalla dose con l'aumento dell'input di pseudovirus.

I pseudovirus senza spike e le cellule non infette mostravano livelli molto bassi di luminescenza. Il composto arbidolo è stato testato per la sua capacità di inibire l'ingresso di pseudo-virus e ha prodotto chiara inibizione della risposta alla dose dell'attività della luciferasi generata dai pseudo-virus spike, con minore inibizione osservata per i pseudovirus VSVG. Il test ha mostrato un fattore primo Z di 0,54, indicando l'idoneità per scopi di screening.

Il trattamento con arbidolo a concentrazioni a partire da 30 micromolari non ha influenzato significativamente la vitalità cellulare rispetto alle cellule trattate solo con il veicolo al 0,5% di dimetilsolfosido. Questo protocollo ha permesso la produzione di pseudovirus ad alto titolo attraverso condizioni ottimizzate. Questo permette ai ricercatori di misurare l'ingresso pseudo-virale e identificare composti che inibiscono l'infezione mediata da picco da SARS-CoV-2.

Un'elevata efficienza di trasfezione è fondamentale per generare pseudovirus ad alto titolo e ottenere segnali di infezione affidabili nei saghi a valle. Questo sistema supporta lo screening antivirale ad alta produttività e la svalutazione degli inibitori di ingresso contro varianti emergenti del SARS-CoV-2 ed è facilmente adattato per generare pseudovirus che mostrano proteine dell'involucro provenienti da altri virus.