Mappatura a livello genomico delle modifiche degli istoni e dei siti di legame dei fattori di trascrizione nelle linee cellulari neuroendocrine di cancro polmonare a piccole cellule utilizzando CUT&RUN

L'obiettivo della nostra ricerca è quindi identificare le interazioni tra i fattori di trascrizione che definiscono la linea di lignaggio e le proteine di rimodellamento della cromatina nei diversi tipi di cancro polmonare a piccole cellule, nella regolazione dei paesaggi trascrizionali e come queste interazioni possano contribuire ai processi patologici, inclusa l'innescenza e la progressione del cancro. Miriamo a raggiungere questo obiettivo conducendo esperimenti come CUT&RUN, una tecnica di sequenziamento di nuova generazione in grado di profilare o identificare su scala globale le posizioni genomiche dove questi istoni differenzialmente modificati e fattori di trascrizione legati al DNA. In definitiva, speriamo di identificare nuove vie che siano regolate epigeneticamente e che possano essere terapeuticamente attuabili nello sviluppo di nuovi trattamenti per i pazienti con questa forma molto aggressiva di cancro ai polmoni.

Per cominciare, rimuovi le cellule neuroendocrine del cancro polmonare a piccole cellule coltivate dall'incubatore a 37 gradi Celsius ed esaminale al microscopio per garantirne la qualità. Successivamente trasferisci la sospensione della cella in un tubo conico da 50 millilitri e centrifuga il tubo a 1.200 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il mezzo dal tubo conico utilizzando il vuoto nel cappuccio e risciacquare il pellet cellulare risultante con 20 millilitri di PBS.

Centrifuga di nuovo il tubo a 1.200 g per cinque minuti e aspira il PBS. Aggiungi Accutase in base alla dimensione del pellet e incuba per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius per digerire il pellet cellulare. Successivamente, interrompi la digestione aggiungendo cinque millilitri di PBS con il 10% di FBS e mescolando per ottenere una sospensione a singola cellula.

Dopo aver centrifugato nuovamente le celle come dimostrato in precedenza, risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS. Conta le celle iniziali e conferma la loro vitalità e integrità usando il contatore automatico delle cellule. Calcola il numero totale di celle necessarie e aggiungi il 20% in eccesso per compensare gli errori di pipettatura.

Trasferire il numero totale calcolato di celle su tubi da 1,5 millilitri e centrifugare i tubi a 600 g per tre minuti a temperatura ambiente. Sospendere le celle nel wash buffer a una densità di cinque volte 10 alla potenza di cinque celle per reazione per un totale di sei reazioni. Usa 100 microlitri di tampone per reazione e pipetta delicatamente ma accuratamente per garantire una sospensione uniforme.

Centrifuga di nuovo le celle, rimuovi il surnante e ripeti il lavaggio. Aliquota 100 microlitri delle cellule lavate in ogni tubo di un set di otto strisce che contiene 10 microlitri di perle di Concanavalina A attivate. Fai una pipetta delicata per mescolare il contenuto.

Incubare la miscela di cellule a perla per 10 minuti a temperatura ambiente per permettere il legame cellulare alle sfere e ruotare rapidamente i tubi in una mini centrifuga per raccogliere la suspense senza permettere alle sfere di depositarsi. Posiziona i tubi su un portacalamine da 0,2 millilitri. Lascia che la pasta si liberi e fai una pipetta per rimuovere il soprandante.

Poi rimuovi i tubi dal magnete. Aggiungi immediatamente 50 microlitri di tampone anticorpali gelati a ogni reazione e fai una pipetta delicata per risospendere le sfere. Etichetta correttamente le otto tubi a strisce.

Aggiungi 0,5 microgrammi ciascuno di anticorpi H3K4me3, H3K4me1 e immunoglobulina G e 0,6 microgrammi di anticorpi policlonali E2F7 provenienti da diverse fonti a ciascun tubo di reazione. Pipettare delicatamente per mescolare accuratamente il contenuto di ogni tubo di reazione e incubarlo durante la notte su un nutator a quattro gradi Celsius con i tappi dei tubi sollevati. Rimuovi gli otto tubi a strisce dal nutatore ed esegui una rapida rotazione per raccogliere liquido sul fondo di ogni tubo.

Ora posiziona i tubi sul supporto magnetico finché la pasta non si libera. Poi pipetta con attenzione per rimuovere e scartare il surnadante. Tenendo i tubi sul supporto magnetico, lava ogni tubo due volte con 200 microlitri di tampone per permeabilizzazione a celle fredde e usa una pipetta multicanale per rimuovere il sovrandante dopo ogni lavaggio.

Poi, rimuovi i tubi dal supporto magnetico. Aggiungi immediatamente 50 microlitri di tampone permeabile alle celle fredde a ogni reazione e fai una pipetta delicata per risospendere cellule e perle. Poi aggiungi 2,5 microlitri di proteina AG-micrococcica nucleasi a ogni reazione e mescola bene pipettando delicatamente.

Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, esegui una rapida rotazione dei tubi. Rimettili sul supporto magnetico finché la pasta non si libera, poi rimuovi il soprantantante. Dopo aver lavato le sfere due volte con il buffer di permeabilizzazione a freddo, risospenderle delicatamente in 50 microlitri del tampone permeabile della cellula.

Mantenendo i tubi sul ghiaccio, aggiungi un microlitro di 100 millimolari cloruro di calcio a ciascuna reazione nella striscia di otto tubi del passaggio precedente. Pipetta delicatamente per sospendere completamente le sfere e favorire una digestione efficiente. Incubare i tubi su un nutatore a quattro gradi Celsius per due ore, mantenendo i tappi dei tubi sollevati durante tutta l'incubazione.

Ora in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, prepara la miscela di stop buffer combinando 33 microlitri di stop buffer con un microlitro di escherichia coli spike nel DNA a 0,5 nanogrammi per reazione. Muovi delicatamente un vortice per mescolare la soluzione. Al termine delle due ore di incubazione, aggiungi 33 microlitri della miscela tampone di stop preparata a ciascun tubo di reazione e mescola accuratamente.

Incubare i tubi di reazione in un termociclatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo una rapida rotazione, posiziona i tubi su un rack magnetico finché la soluzione non diventa pulita. Trasferire con attenzione circa 85 microlitri del sovrantato contenente il DNA rilasciato CUT&RUN in tubi freschi da 1,5 millilitri.

Purificare il DNA recuperato, valutarne la quantità ed eseguire la distribuzione delle dimensioni dei frammenti per il controllo della qualità. Successivamente procedi con la preparazione delle librerie CUT&RUN, la quantificazione, il pooling delle librerie indicizzate e il sequenziamento di nuova generazione a pari e a fianco di nuova generazione. Linee cellulari ad alto livello di omologo dell'Achaete-scute, DMS79 e H146, e linee cellulari ad alto Fattore di Differenziazione Neurogenica 1, H82 cresceva come aggregati non aderenti o sferoidi compatti in sospensione, mentre H446 presentava una morfologia mista, con circa l'80% di cellule intrinsece e il 20% in sospensione.

L'analisi dei frammenti di DNA CUT&RUN ha rivelato che il marchio degli istoni potenziatori H3K4me1 ha prodotto le quantità più alte di DNA su tutte le linee cellulari, seguito da H3K4me3, con E2F7 e IgG che hanno prodotto le quantità più basse. Per il DNA estratto CUT&RUN, la distribuzione delle dimensioni dei frammenti per H3K4me1 e H3K4me3 ha mostrato picchi chiari per mononucleosomi e dinucleosomi insieme al DNA genomico. Al contrario, non sono stati rilevati picchi distinti per E2F7 o per il controllo IgG.

Nonostante il basso input di DNA, librerie di sequenziamento di nuova generazione furono costruite con successo per tutti i target CUT&RUN, inclusi E2F7 e IgG. L'analisi della mappa termica nelle cellule selvatiche di tipo DMS79 e mutanti eterozigoti H146 ha mostrato che i segnali H3K4me3 ed E2F7 erano arricchiti vicino ai siti di inizio della trascrizione, mentre quelli H3K4me1 erano più ampiamente distribuiti. La visualizzazione del browser genomico in una regione della cromatina selezionata casualmente ha mostrato picchi distinti per H3K4me3, H3K4me1 ed E2F7, mentre IgG non ha mostrato arricchimento.

E così, tradizionalmente, scienziati e ricercatori hanno utilizzato l'immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento o ChIP-seq per affrontare domande come quelle che stiamo ponendo. Tuttavia, il ChIP-seq richiede una quantità piuttosto elevata di materiali in ingresso, cosa non sempre fattibile, a seconda del modello utilizzato. CUT&RUN, invece, richiede significativamente meno materiale di input, fino a 50.000 celle, e richiede letture di sequenziamento ad alta produttività, il che significa che è meno costoso e produce molto meno background per la generazione dei dati.

CUT&RUN è una tecnica applicabile non solo alle cellule in coltura 2D, ma può essere adattata anche ad altri modelli preclinici, come organoidi derivati dal paziente e xenoinnesti. Può anche essere utilizzata per profilare il paesaggio della cromatina nei tessuti, inclusi sia quelli normali che malati. Questa è quindi una tecnologia o una tecnica incredibilmente utile per i ricercatori oncologici, ma può essere molto utile anche per i ricercatori non oncologici che si concentrano sullo studio di diverse malattie umane.

Questo protocollo consente una mappatura delle modifiche degli istoni e dei profili permanenti delle diverse proteine in situ nel genoma cellulare. Fornire PTM di istoni e il legame della TF tra i sottotipi SCLC può rivelare geni mirabili specifici per sottotipo e elementi regolatori, come potenziatori e super-potenziatori.