Localizzato RNAi e di espressione genica ectopica nel Leech medicinali

Il sanguisuga medicinale è un sistema modello utile per studi neurobiologici grazie alla sua semplicità, accessibilità e alla possibilità di identificare neuroni stabili con numerosi strumenti sperimentali diversi, dall'embriogenesi precoce fino all'età avanzata. Un'applicazione particolarmente interessante dell'embrione di sanguisuga è lo studio mediante imaging a intervalli temporali delle espansioni neuronali in animali vivi e integri, a seguito di modifiche molto precise dell'espressione genica nel neurone in studio o nei suoi bersagli. In questo video, dimostriamo una nuova tecnologia per il rilascio rapido, preciso e altamente localizzato di reagenti negli strati interni di embrioni vivi di sanguisuga, utilizzando una pistola pneumatica a capillare sviluppata in collaborazione tra il laboratorio di Alex Grossman e il nostro laboratorio.

Sebbene questa tecnica possa essere applicata al rilascio di DNA o RNA a doppio filamento e di qualsiasi altra molecola che possa essere caricata su particelle microscopiche d'oro, la utilizzeremo sia per l'abbattimento che per l'inserzione della molecola di guida dell'assone Rin. Ciao, sono del laboratorio di Eduardo Ano della Divisione di Scienze Biologiche dell'Università della California di San Diego. Oggi vi mostreremo un procedimento per ridurre o aumentare l'espressione della molecola di guida dell'assone denominata networking, che è naturalmente espressa nella parete ventrale del corpo, ma non nel dominio dorsale di tutti i segmenti corporei del lech.

Introdurremo molecole di RNA a doppio filamento o DNA plasmidico nella parete corporea e nei gangli di segmenti selezionati in fasi precoci dello sviluppo. La somministrazione globale mediante pistola pneumatica a capillare è particolarmente importante perché consente di perturbare i modelli di espressione genica in aree selezionate del sottosegmento, lasciando i segmenti non trattati come controllo interno. Inoltre, può essere utilizzata per raggiungere strati interni di cellule in fasi precoci dello sviluppo senza danneggiare il tessuto e senza aprire il campione.

Infine, la somministrazione olistica presenta il vantaggio di poter bersagliare un numero limitato di cellule in una posizione selezionata, una via di mezzo tra il silenziamento singola cellula mediante microiniezione e il silenziamento sistemico attraverso approcci genetici. Cominciamo dunque. Il LE medicinale è stato a lungo utilizzato per studiare le proprietà delle cellule nervose e dei circuiti neurologici correlati al comportamento, grazie alla semplicità del sistema nervoso centrale, costituito da circa 200 paia bilaterali di neuroni e da un piccolo insieme di grandi cellule gliali.

Ogni ganglio segmentale dei 21 segmenti corporei, ogni neurone della sanguisuga, può essere ripetutamente identificato e studiato da esemplare a esemplare, dall'embrione iniziale all'adulto maturo. Fin dall'epoca dei Faraoni, la sanguisuga è stata utilizzata per scopi di salassoterapia e il suo impiego continuo in medicina la rende facilmente disponibile presso fornitori commerciali di animali. Tuttavia, poiché studiamo lo sviluppo del sistema nervoso, manteniamo nel nostro laboratorio una colonia riproduttiva di diverse centinaia di sanguisughe, che ci fornisce una fornitura costante di embrioni per i nostri esperimenti.

I sanguisughe sono ermafrodite. Possiedono strutture sia femminili che maschili e si fecondano incrociando. Pertanto, tutti i campioni possono deporre uova.

Questo viene fatto all'interno di una struttura chiamata bozzolo, che essi stessi producono utilizzando un insieme di ghiandole specializzate che secernono polimeri molto interessanti in una regione del corpo nota come clitello. Quando è pronta per deporre le uova, una sanguisuga si seppellisce nel muschio, che forniamo noi nelle vasche, e inizia a formare attorno al proprio corpo questo bozzolo di forma ovale; una volta che è stata secreta una quantità sufficiente di materiale e le molecole hanno iniziato a polimerizzarsi, la sanguisuga deposita all'interno del bozzolo le uova e anche una riserva nutritiva sotto forma di tuorlo, per poi uscire contorcendosi. Utilizzando una lametta da rasoio, possiamo estrarre gli embrioni praticando un'apertura a finestra su un'estremità del bozzolo.

Generalmente, ogni bozzolo contiene da 10 a 20 embrioni a partire da circa il sesto giorno successivo all'inizio della loro differenziazione. Gli embrioni possono essere rimossi dal bozzolo ed allevati in acqua di stagno. Sono proprio in questi stadi che di solito iniziamo i nostri studi sperimentali sullo sviluppo neuronale.

Il primo passaggio fondamentale di questa procedura è la preparazione delle particelle rivestite. In questa dimostrazione, mostreremo come consegnare particelle d'oro rivestite con molecole di RNA a doppio filamento dell'omologo lech della molecola di guida assonale rin negli embrioni di lech. Le cellule bersaglio sono le cellule muscolari longitudinali ventrali della parete corporea, che sono note per esprimere e rilasciare Rin a partire dalle prime fasi dell'Agenesia.

Il nostro obiettivo è ridurre l'espressione naturale in un singolo segmento corporeo il più precocemente possibile durante lo sviluppo, e osservare come ciò influisca sulla categorizzazione dei neuroni sensibili a questo importante fattore dello sviluppo. Per questo passaggio, sono necessari un bagno a ultrasuoni, un vortex, una centrifuga da banco e un secchiello con ghiaccio. È inoltre necessario l'isopropanolo al 100%, che deve essere raffreddato sul ghiaccio prima dell'uso.

Iniziare con 100 microlitri di buffer di legame contenente 50 milligrammi di particelle vault per millilitro. Queste particelle sono progettate per l'RNAi e prodotte dalla società chell. Successivamente, diluire la soluzione delle particelle aggiungendo 100 microlitri di buffer di legame, vortexare brevemente e sottoporre a sonica per uno o due minuti per separare le particelle che potrebbero essersi aggregate.

Dopo due minuti di sindacazione, aggiungere da cinque a dieci microgrammi di RNA a doppio filamento alle particelle, vortexare e lasciare a temperatura ambiente per due minuti. Ora che i due minuti sono trascorsi, centrifugare i complessi di particelle di RNA a doppio filamento ad almeno 2.500 g in una microcentrifuga per circa 15 secondi.

Per ottenere il pellet, rimuovere il soprannatante e aggiungere 750 microlitri di isopropanolo, chiamato isopropanolo, con il minimo disturbo del pellet. Centrifugare brevemente in microcentrifuga e rimuovere il soprannatante dopo la centrifugazione; quindi sospendere le particelle d'oro in isopropanolo al 100% freddo mediante sonificazione. In breve, applicare da due a tre impulsi nella migliore sonificazione per separare le particelle.

Versare su un vetrino e lasciare evaporare completamente il solvente. I migliori risultati si ottengono quando le particelle vengono rivestite immediatamente prima della somministrazione al tessuto, come vi mostreremo nel prossimo passaggio. Prima di eseguire la trasfezione istica, esaminiamo l'allestimento sperimentale e come prepararlo.

La pistola capillare pneumatica è montata su un micromanipolatore per un'accurata somministrazione di particelle negli embrioni. La superficie dell'embrione viene immaginata mediante un microscopio video. Un laser a semiconduttore genera un fascio di luce diretto attraverso il capillare interno della pistola e utilizzato per prendere di mira il tessuto bersaglio.

Linee separate di tubi Titan collegati ai tre ingressi della testa della pistola forniscono gas elio pressurizzato da un'unica fonte. Una linea è sempre aperta, creando un flusso continuo di gas elio attraverso la pistola. Le altre due linee sono normalmente chiuse con una valvola solenoide e contengono particelle d'oro con due rivestimenti diversi che sono state caricate nel tubo.

Come polvere secca. Il capillare esterno della pistola è collegato a un sistema a vuoto con una pressione relativa di meno 12,5 PSI. La pressione della testa dell'hi viene variata tra 10 e 15 PSI per regolare la profondità desiderata di penetrazione delle particelle.

La pressione del gas elio può influenzare notevolmente la profondità di penetrazione delle particelle, così come può fare la distanza tra l'embrione e la pistola. Il diametro dell'ugello, che varia a seconda dei diversi tipi di pistole geniche, è importante sceglierlo in base all'area bersaglio. Ora che abbiamo mostrato il nostro apparato sperimentale, carichiamo la nostra pistola Jing ed esponiamo alcuni embrioni di lech.

Prima di caricare il tubo Titan, è fondamentale che le particelle d'oro rivestite siano completamente asciutte. Le particelle d'oro rivestite vengono prima raschiate dalle vetrini utilizzando un coprioggetto o una lametta e sono pronte per essere caricate nel foglio di carta da filtraggio piegato. Il tubo deve essere piegato a forma di U vicino al connettore in modo che le particelle non si distribuiscano lungo l'intero tubo durante il caricamento, ma si concentrino vicino al connettore.

Prelevare le particelle con una piccola spatola o con un pezzo di carta pesata a forma di V e caricare il tubicino. Agitare leggermente il tubicino con il dito durante il caricamento per distribuire uniformemente le particelle. Dopo aver caricato il tubicino, possiamo procedere con la somministrazione dell'RNA a doppio filamento mediante la pistola Jing, ma non prima di aver preparato le nostre sanguisughe.

Qui potete vedere i nostri embrioni di sanguisuga, che hanno circa 10 giorni. Sono ora in un mezzo sterile in cui verranno mantenuti sia prima che dopo la somministrazione di RNA a doppio filamento. Il primo passo nella preparazione degli embrioni sperimentali per la somministrazione di RNA a doppio filamento consiste nell'aggiungere una soluzione di etanolo all'8% in mezzo sterile su un pezzo piatto di silicone flessibile dotato di una scanalatura a forma di V.

Si aggiunge un embrione e lo si posiziona con il lato ventrale rivolto verso l'alto immediatamente prima di sparare le particelle. Il mezzo nella camera viene abbassato appena al di sotto della superficie superiore dell'embrione, e un pezzo di carta da filtro con un piccolo foro al centro viene posizionato sopra di esso per stabilizzarlo e impedire che la superficie si secchi, esponendo al contempo soltanto l'area che verrà bersagliata nello stadio embrionale che stiamo utilizzando oggi. Allo stadio E 10, le cellule dei muscoli longitudinali possono essere localizzate a circa 10-20 micrometri dalla superficie esterna, internamente all'epidermide, al derma e ai muscoli circolari.

A differenza delle cellule muscolari, i gangli centrali situati sul lato ventrale degli embrioni negli stadi embrionali con cui lavoriamo, da E7 a E12, si trovano a circa 50 micrometri di profondità rispetto alla superficie ventrale del corpo. Regoleremo la pressione dell'elio in modo da colpire i muscoli longitudinali, che si trovano a una profondità più superficiale rispetto ai gangli. Ora siamo pronti a colpire i muscoli longitudinali con particelle d'oro.

Un carico di particelle d'oro del peso di circa mezzo milligrammo può essere utilizzato tipicamente per fino a 10 colpi, con un singolo colpo che di solito rilascia alcune centinaia di particelle. Un colpo viene generato aprendo brevemente una delle valvole per 0,3 secondi, causando l'iniezione di un bolo di particelle dalla relativa linea di tubo all'interno dell'anima della pistola. Per coprire l'area di tessuto di interesse, spesso sono necessari più colpi.

Il tubo viene leggermente picchiettato tra un'iniezione e l'altra per staccare alcune particelle e facilitarne l'ingresso nel flusso continuo di elio all'interno della canna della pistola. Se si desidera somministrare un secondo reagente nello stesso saggio, è possibile caricare particelle alternative in un secondo tubo immediatamente dopo il rilascio delle particelle d'oro. Gli embrioni vengono rimessi nell'acqua artificiale di stagno, preferibilmente uno per piastra, per uno a tre giorni, fino a quando l'RNAi o l'espressione ectopica non vengono ritenuti sufficienti.

Durante questo periodo, gli embrioni vengono mantenuti in una camera oscurata a temperatura ambiente. Ecco un'analisi dell'ibridazione ceto per il silenziamento di Mr.NA, narine. Si può osservare che nell'embrione trattato, poche cellule muscolari non esprimono terrin.

Questi muscoli contengono particelle. Si può osservare che quando le particelle sono state rivestite con RNA a doppio filamento di terrina, si verifica un abbattimento chiaramente visibile dell'espressione di narin, che si manifesta esclusivamente nelle cellule contenenti particelle, solitamente da una a due particelle per cellula. Quando si rivestono le particelle con un plasmide che codifica per GFP, si ottiene fluorescenza nelle cellule neuronali nel momento in cui si fermano nei loro nuclei mediante la pistola a capillare pneumatica da noi utilizzata.

In questa dimostrazione, siamo stati in grado di consegnare entrambe le particelle all'interno delle cellule in un piccolo volume localizzato di un embrione vivo senza causare danni rilevabili alle cellule nell'area bersaglio. Abbiamo inoltre mostrato come la micropipetta capillare nomade conferisca alla tecnica la capacità di un'immisione globale e di nuove possibilità di attivare o silenziare geni in una regione microscopica di un tessuto confinata in tre dimensioni e colpita con elevata precisione, senza danni rilevabili al tessuto. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.