Analisi del DNA microbico sul campo utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo e un'unità qPCR sul campo

L'ambito della nostra ricerca prevede davvero l'esecuzione di analisi molecolari che possiamo utilizzare per caratterizzare i microbi coinvolti nella bonifica, nell'estrazione mineraria, nella prevenzione della corrosione, e ci aiuta davvero a rispondere a domande sulla sostenibilità. Questa ricerca affronta numerose lacune di ricerca e accessibilità attraverso l'uso di flussi di lavoro biologici molecolari affidabili e portatili sul campo, semplici da usare. Sblocca entrambe le estremità del filtro e collega una siringa da tre millilitri riempita d'aria al filtro usando la connessione con il blocco del luer.

Spingi l'aria per espellere l'acqua residua. Scollega la siringa e tira più aria prima di ripetere. Poi, ricappucchio il tappo rosso della presa.

Inverti la soluzione con una siringa per mescolarla. Rimuovere il tappo della siringa di blocco Luer e collegare la siringa Solution A all'ingresso del filtro incapsulato da 0,2 micrometri tramite la punta di blocco Luer. Premi lo sturalavandini per aggiungere lentamente la Soluzione A. Poi, scuoti vigorosamente il filtro chiuso con la mano per cinque minuti.

Ora, inverti la siringa della Soluzione B più volte per mescolarla. Rimuovi il tappo di bloccaggio Luer e collega la siringa all'ingresso del filtro incapsulato tramite la punta di bloccaggio Luer. Dopo aver ritappato il tappo del filtro di ingresso, agita vigorosamente il filtro chiuso a mano per cinque minuti.

Rimuovi il tappo di ingresso e inverti il filtro. Usa una siringa da tre millilitri collegata all'unità di filtro incapsulato per spingere un millilitro d'aria nel filtro. Poi, tira indietro lo sturalavandini per rimuovere tutto il lisato.

Trasferisci il lisato in un tubo a perline da cinque millilitri. Dopo averlo sigillato con parafilm, scuoti energicamente il tubo a sfere per cinque minuti prima di posizionarlo in posizione verticale. Posizionare la cartuccia di preparazione del campione su una superficie piana e fissare una colonna Luer bloccabile a una siringa da un millilitro.

Usa la punta appuntita della colonna per fare due fori nella prima sezione della cartuccia di preparazione del campione. Pipetta un millilitro di lisato dal tubo delle perline nel foro appena perforato nella prima sezione della cartuccia. Inserisci la colonna della siringa nella sezione rossa della cartuccia.

Poi, tira completamente il liquido nella siringa e poi spingilo fuori 10 volte. Ora, posiziona la punta appuntita della colonna della siringa sopra la sezione rosso-arancione e perfora due fori attraverso la barriera della carta stagnola. Usando lo sturalavandini, tira tutto il volume di fluido della siringa fino all'interno della siringa e pompa completamente il liquido fuori.

Allo stesso modo, usa la colonna della siringa per perforare e pompare le sezioni arancione, gialla, blu, asciugatrice all'aria e verde, tirando e premendo lo sturalavandini il numero di volte indicato nella sezione. Poi, si utilizza la siringa da un millilitro e la colonna di preparazione del campione per trasferire tutta la soluzione dalla sezione verde in un microtubo da un millilitro ben etichettato. Inserire fino a tre campioni di DNA estratti sul campo nel vassoio puro di un strumento qPCR basato sul campo, assicurando un campione per sezione designata.

Posizionare le strisce di analisi per ogni campione nelle corrispondenti fessure A, B o C sulla vassoia, allineando il primo pozzetto di ogni striscia con la prima fessura sulla vassoia. Sblocca il telefono e apri l'applicazione intitolata allo strumento qPCR registrato. Quando l'applicazione si apre, tocca il pulsante Start Run.

Nella schermata successiva, tocca il pulsante Genera ID. Inserisci le informazioni del campione toccando sotto Sample ID e digitando il nome del campione. Tocca le unità campioni e seleziona l'unità appropriata, poi tocca sotto la quantità di campione e inserisci il volume utilizzato durante l'estrazione.

Dopo aver inserito le informazioni su tutti i campioni, premi il pulsante Continua. Nella schermata successiva, tocca l'icona della cartella e poi tocca Salva nella cartella attuale. Digita il nome della run e tocca Conferma.

Accendi lo strumento premendo e tenendo premuto il pulsante di accensione finché tutte le luci anteriori non si accendono. Tocca Conferma nella domanda per procedere. Premi connect tramite wireless integrato a corto raggio nell'applicazione.

Premi il pulsante wireless integrato a corto raggio sullo strumento finché la luce blu non lampeggia. Poi tocca Conferma e seleziona il nome dello strumento per connettere. Rimuovi i tappi dai tubi delle striscie di uso per il primo campione.

Aggiungi 18 microlitri di acqua sterile in ogni pozzo e fai una pipetta delicata per sciogliere il pellet. Aggiungi due microlitri di campione in ciascun pozzo e sigilla i tubetti con tappi di gomma per le strisce di saggio, assicurando la corretta orientazione. Clicca Conferma nell'applicazione una volta che tutte le strisce sono pronte.

Rimuovi ogni striscia per il saggio. Controlla la presenza di bolle sul fondo dei pozzi, poi fai oscillare delicatamente la striscia finché le bolle non si alzano. Tocca Conferma per procedere.

Apri il coperchio dello strumento e posiziona le strisce di analisi nello strumento nell'ordine e nell'orientamento corretti. Chiudi il coperchio finché non si blocca e tocca Conferma. Premi il pulsante Start Run nell'applicazione per iniziare la run.

Quando la corsa termina, tocca Email Results. Una volta connesso a internet wireless, tocca Invia di nuovo per trasmettere i risultati. Pulisci accuratamente il vassoio tra una corsa e l'altra per evitare contaminazioni.

Il completamento riuscito dell'isolamento del DNA utilizzando il kit di estrazione biologica sul campo è stato confermato da risultati qPCR coerenti rispetto a un metodo validato basato su laboratorio. La diluizione standard della coltura dei Dehalococcoidi analizzati utilizzando l'unità qPCR basata sul campo ha mostrato una bassa deviazione in 10 ripetizioni sia a 21 gradi Celsius che a 30 gradi Celsius. I test di precisione degli strumenti sul campo hanno mostrato una deviazione standard relativa inferiore al 5% su tutte le riprese.

Quindi i nostri risultati fanno davvero avanzare il campo permettendo il monitoraggio ambientale in queste località remote, favorendo l'accessibilità, il coinvolgimento della comunità e generando ricerche scientifiche di grande impatto. I nostri risultati hanno aperto la strada per comprendere come i campioni cambiano durante la spedizione rispetto all'estrazione e analisi immediate. Le ricerche future si concentreranno sulla definizione dei limiti di questi metodi per campioni estremi come la salamoia, così come per condizioni meteorologiche estreme.