Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi
10 aprile 2026
Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.
La nostra ricerca indaga per la prima volta la morfologia mitocondriale delle cellule terminali di Schwann alla giunzione neuromuscolare. Il nostro approccio consente la quantificazione della morfologia mitocondriale in tessuti altrimenti difficili da ottenere, come i letti capillari e linfatici. Per cominciare, ottieni un tipo selvaggio e un mouse D2-mdx.
Dopo aver confermato la profondità anestetica tramite riflesso di pizzicamento del dito del piede, inserire l'ago al tendine distale verso il ginocchio destro. Inietta 50 microlitri di colorazione mitocondriale fluorescente a due micromolari di rosso lontano sull'interno del muscolo tibiale, ovvero il TA, mentre si preleva l'ago lungo il percorso di iniezione, e incuba il colorante in vivo per un'ora. Durante l'anestesia, si utilizzano forbici e forcelle per sezionare e isolare il muscolo TA prima dell'eutanasia.
Posiziona il muscolo TA isolato nel paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 minuti. Poi, sotto un microscopio stereoscopico, separare delicatamente le fibre con le provocazioni. Aggiungere la colorazione cellulare permanente agli acidi nucleici al 4% di paraformaldeide per ottenere una concentrazione finale di cinque a dieci microgrammi per millilitro per la marcatura nucleare.
Poi, lava il muscolo TA tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno per rimuovere il colorante in eccesso. Disidrata il muscolo in modo sequenziale con 50%75% e 100% etanolo per cinque minuti ciascuno. Successivamente, incubare il campione in sequenza in soluzioni di pulizia tessuti uno e due per 30 minuti ciascuna, assicurandosi che siano completamente immersi.
Metti il muscolo su una copertura. Usa un blocco di vetro da 2,5 per 2 per 1 centimetro del peso di 7,8 grammi per appiattirlo delicatamente. Procura un mouse beta S100.
Dopo aver confermato la profondità anestetica tramite riflesso di pizzicamento delle dita, fai una piccola incisione cutanea sopra il muscolo del gluteo massimo, o GM. Inietta 75 microlitri di colorazione mitocondriale fluorescente a due micromolari rosso lontano sotto il muscolo GM. Chiudi la ferita e lascia incubare il colorante per 45 minuti per etichettare selettivamente le cellule terminali di Schwann.
Durante l'anestesia, sezionare il muscolo GM entro 10 minuti e immediatamente inserirlo in soluzione salina sterile al 0,9%. Solo se si usano topi D2-mdx, si aggiunge il colorante fluorescente del recettore dell'acetilcolina a una diluizione da uno a 500 nel bagno di microdissezione e incuba il tessuto per 30 minuti. Taglia il grasso e il tessuto connettivo in eccesso, e trasferisci il muscolo GM su una copertura con il lato ventrale rivolto verso il basso per la microscopia invertita.
Aggiungi due microlitri di mezzo di montaggio generale sulla superficie dorsale del GM e appiattisci il tessuto usando un blocco di vetro prima dell'imaging. Nel software, imposta la lunghezza d'onda dell'eccitazione a 646 nanometri. Dopo aver aggiunto due gocce di soluzione di clearing second, selezionare l'obiettivo 63X per visualizzare il muscolo TA e impostare la profondità dello stack Z vicino a 100 micrometri.
Poi, seleziona la modalità deconvoluzione e applica parametri ottimizzati dal sistema. Imposta la dimensione del passo a un micrometro e acquisisci immagini. Per acquisire immagini delle celle Schwann terminali, selezionare l'obiettivo a ingrandimento 20 volte, impostare la profondità dello stack Z a circa 17 micrometri e acquisire immagini.
Successivamente, seleziona l'obiettivo a ingrandimento 63 volte e acquisisci immagini delle singole cellule terminali di Schwann. Importare singole Z slice per addestrare il software a riconoscere il segnale mitocondriale. E condurre analisi quantitative utilizzando software basati sull'IA.
Sviluppare maschere per immagini per la revisione da parte degli investigatori. Separare gli stack di immagini 3D in singole sezioni ottiche dopo l'ottimizzazione degli algoritmi. Seleziona ogni quinta Z slice da ogni immagine 3D e calcola la media per campione.
Standardizzare i parametri di imaging su tutti i campioni e quantificare la morfologia mitocondriale. Eseguire immunoistochimica e analisi statistiche per valutare le differenze e le correlazioni tra gruppi. La connettività mitocondriale è stata ridotta nel muscolo mdx rispetto ai topi di tipo selvatico.
Un numero maggiore di piccoli frammenti mitocondriali e un numero ridotto di grandi reti mitocondriali interconnesse sono stati osservati nei topi mdx. Nei topi di tipo selvatico, i mitocondri nelle cellule terminali di Schwann mostravano strutture ad anello interconnesse vicino alle biforcazioni. Al contrario, nei topi mdx, i mitocondri apparivano frammentati e privi di formazioni ad anello vicino alle biforcazioni.
La microscopia confocale ed elettronica ha confermato strutture mitocondriali simili a forma di ciambella nelle cellule terminali di Schwann. L'analisi postsinaptica ha mostrato mitocondri sub-sarcolemmatici raggruppati attorno ai recettori dell'acetilcolina, privi della caratteristica struttura simile a un pretzel. L'analisi delle immagini ha rivelato che i mitocondri delle cellule terminali di Schwann nel muscolo mdx mostravano un'area e una frammentazione aumentati rispetto al muscolo di tipo selvatico, senza differenze nella dimensione relativa delle particelle.
Le misurazioni della forza muscolare hanno mostrato una riduzione dei contratti con maggiore variabilità e una diminuzione della forza di picco nel muscolo MDX. La produzione di forza attraverso l'aumento delle frequenze di stimolazione è stata significativamente ridotta anche nei muscoli mdx. Il muscolo mdx mostrava uno spostamento verso sinistra nella dimensione della fibra, indicando miofibre circa del 60% più piccole rispetto al tipo selvatico.
Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare e quantificare la morfologia mitocondriale nel muscolo scheletrico e nelle cellule terminali di Schwann. Studi futuri possono adattare questo approccio per indagare la morfologia mitocondriale nella microcircolazione e nei vasi linfatici.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
