Un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate

Le principali domande a cui vogliamo rispondere sono quali siano la risposta immunitaria sinoviale nativa agli stimoli infettivi e infiammatori e come ciò si rifletta nelle alterazioni della struttura sinoviale. Il mio principale obiettivo clinico e di ricerca è il trattamento di pazienti gravemente obesi con artrite RC in fase terminale. Spesso in questa popolazione di pazienti, sono stati trascurati dal punto di vista medico data la difficoltà di trovare opzioni di trattamento chirurgico per la loro malattia.

Per iniziare, eseguire artrotomia e dissezione in sala operatoria. Utilizzare un approccio mediale parapatellare standard e eseguire un'esposizione più estensiva quando si opera su un paziente con obesità morbosa e artrosi in fase terminale. Identificare la sinovia anteriore e utilizzare l'elettrocauterio per dissezionare il tessuto.

Osservare il ginocchio per segni di infiammazione, poiché i pazienti con obesità possono mostrare una risposta infiammatoria locale che si correla con gli effetti infiammatori più ampi dell'obesità. Passare la sinovia al membro del team di ricerca in modo sterile. Posizionare il contenitore del campione riempito con Dulbecco's PBS o DPBS freddo sul ghiaccio e trasferire il tessuto sinoviale anteriore umano acquisito durante l'artroplastica totale del ginocchio nel contenitore.

Lavare il tessuto due volte in DPBS freddo per 10 minuti su una piastra rocker. Quindi, trasferire la sinovia in una provetta sterile da 10 centimetri o più grande sotto un armadio di livello di sicurezza biologica 2. Aggiungere DMEM sterile a basso glucosio con piruvato di sodio e L-glutamina per riempire la provetta a metà.

Identificare il rivestimento sinoviale dal lato intimale perlaceo senza staccarlo. Organizzare gli strumenti necessari per ottenere campioni di biopsia di tre millimetri per un minimo di due repliche tecniche. Utilizzando forbici a iris o un bisturi, dissezionare il tessuto adiposo e stromale in eccesso dal lato cauterizzato per isolare la sinovia, mantenendo una profondità del tessuto di circa quattro-cinque millimetri in tutto.

Cambiare il terreno della provetta se necessario per mantenere il campo visivo. Posizionare il tessuto con il rivestimento sinoviale rivolto verso lo strumento di prelievo. Stabilizzare il tessuto con la mano non dominante utilizzando pinze o emostatici e prelevare il tessuto applicando una pressione perpendicolare e una leggera torsione.

Sostituire il punzone per biopsia dopo circa 10-15 usi o quando il tessuto si torce durante il prelievo per evitare di danneggiare la struttura dell'intima. Aprire una seconda provetta e riempirla con cinque-dieci millilitri di terreno contenente 10%FBS temperato a 37 gradi Celsius. Con pinze piatte o non dentate, trasferire i campioni nella provetta e agitare delicatamente per uno-due secondi per lavare via i detriti senza stringere troppo.

Per preparare il pozzo inferiore del Sistema di Analisi dello Spazio Articolare, aggiungere 600 microlitri di DMEM a basso glucosio contenente 10%FBS temperato a 37 gradi Celsius. Aggiungere il controllo veicolo o il reagente di trattamento scelto, come LPS o MCP-1, al pozzo inferiore. Selezionare la dimensione del poro del transwell in base al risultato sperimentale desiderato e aggiungere 300 microlitri di DMEM a basso glucosio contenente 10%FBS al transwell.

Utilizzando pinze sterili, trasferire delicatamente i singoli campioni di tessuto nel terreno del transwell, evitando campioni sfilacciati e galleggianti. Quindi, posizionare l'assieme in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5%di anidride carbonica per otto-72 ore a seconda dei saggi successivi da eseguire. Fissare il tessuto sinoviale in formalina tamponata neutra al 10%.

Poi incastonarlo e sezionarlo per l'analisi istologica. Dopo aver colorato con ematossilina ed eosina, fotografare le sezioni di tessuto a 10X e 40X utilizzando microscopia a campo chiaro. Utilizzare Photoshop per delineare l'intima e le regioni subintimale nell'immagine TIFF 40X, mascherando aree non target, eritrociti e grande vascolarizzazione per la successiva analisi quantitativa.

Analizzare le maschere finali per quantificare lo spessore, l'integrità e la cellularità dell'intima e del subintimal. Infine, valutare le cellule migratorie mediante citometria a flusso e i fattori solubili nel terreno raccolto mediante enzimatico-linked immunosorbent assay. Il tessuto sinoviale coltivato con dosi crescenti di MCP-1 o LPS ha mostrato distinti cambiamenti nella morfologia dell'intima, tra cui un'intima friabile e un'intima ispessita con una diminuzione della densità cellulare rispetto al controllo.

Il trattamento con MCP-1 e LPS ha alterato la risposta citochinica sinoviale. MCP-1 ha indotto l'espressione del marcatore di fibroblasti patogeni podoplanina nel subintimal, mentre LPS ha aumentato la podoplanina sia nell'intima che nel subintimal. Le cellule immunitarie migratorie nel pozzo inferiore includevano neutrofili, cellule NK, cellule NKT, cellule T, cellule B o cellule dendritiche, monociti o macrofagi e macrofagi M2.

Le cellule T erano le cellule immunitarie migratorie più abbondanti. Statisticamente, non c'era differenza nella migrazione cellulare basata sullo stimolo del pozzo inferiore. L'osteoprotegerina, una proteina rilevante per l'artrite, è stata rilevata a 24, 48 e 72 ore nel sinovio artritico non trattato e era significativamente più alta a 72 ore rispetto a 24 ore.

L'espressione dell'ossido nitrico sintasi indotta nell'intima era elevata nei controlli a zero ore ed era quasi assente dopo 24 ore. L'espressione dell'ossido nitrico sintasi è stata mantenuta quando trattata con N-acetil cisteina. Al contrario, l'N-acetil cisteina non ha alterato l'espressione della metalloproteinasi-9, un marcatore sia della sinovite che del potenziale danno cartilagineo.

Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare le alterazioni negli strati intimali e subintimali sinoviali, inclusa la profondità, la cellularità e l'integrità, che sono tutti indicativi di infiammazione. Le considerazioni più importanti durante l'esecuzione di questo protocollo sono l'acquisizione di tessuto vitale da donatori appropriati, la sterilità e l'identificazione dell'intima per la selezione della biopsia. Studi futuri valuteranno il miglioramento della durata della coltura del tessuto vitale per valutare la rigenerazione dell'intima sinoviale.