Name: Un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri il sistema JSAS per modellare la sinovite umana ex vivo con architettura preservata. Questo metodo consente di studiare risposte acute a stimoli infiammatori e infettivi, mantenendo la funzionalità tissutale per la ricerca preclinica sull'artrite.

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<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>23srRNA RNAscope probe</td><td>ACD/Biotechne</td><td>468211</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Life Sciences</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>3 mm biopsy punches</td><td>Integra</td><td>12460406</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicals</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol (for sterilization)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borrelia burgdorferi</td><td>ATCC</td><td>35210&nbsp;</td><td>deve essere utilizzato nella fase di crescita esponenziale tardiva per la massima patogenicità</td></tr><tr><td>BSK-H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8291</td><td></td></tr><tr><td>CD68 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CO2 tank (standard conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Biotechne</td><td>S11150</td><td>Heat inactivated Lot: F22100</td></tr><tr><td>forceps (non-toothed)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified cell incubator (standard conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia incubator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4 antibody</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-42470</td><td>1:100</td></tr><tr><td>iNOS antibody</td><td>Thermofisher</td><td>PA1-036</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>MMP9 antibody</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-32705</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)</td><td>Emrbient, Inc</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Monocyte chemoattractant protein 1</td><td>Peptrotech</td><td>300-04-20UG</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Deve essere preparato fresco per ogni esperimento e tamponato in bicarbonato di sodio equimolare a un pH di 7-7.4</td></tr><tr><td>OPG ELISA</td><td>Millipore</td><td>RAB0484</td><td>1:1 dilution</td></tr><tr><td>Oxygen tank with liter per minute flow regulator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDPN antibody</td><td>Invitrogen</td><td>14-9381-82</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermofisher</td><td>J66764.MC</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope multiplex fluorescent V2 assay</td><td>ACD/Biotechne</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>sRANKL ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS262624</td><td>1:1 dilution</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus USA 300 MRSA</td><td>ATCC</td><td>BAA-1717</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermofisher</td><td>S7563</td><td>10,000X stock</td></tr><tr><td>TNF antibody</td><td>Thermofisher</td><td>PA5-19810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>transwell inserts - 0.4 um size</td><td>Millicell</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>transwell inserts - 5 um size</td><td>Corning</td><td>CLS3421</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate

A Pre-Clinical Model of Synovitis Using Ex vivo Human Synovial Tissue with Preserved Function and Architecture

Ottimizzazione delle condizioni di coltura dell'ossigeno
La perfusione fisiologica del tessuto è circa al 6%-8% di ossigeno, mentre le condizioni standard di incubazione per la coltura cellulare sono ai livelli di ossigeno atmosferico (~21%)16. In confronto, l'iperossigenazione può migliorare la vitalità delle colture cellulari o esseretossica 17. L'adeguato utilizzo del JSAS ha reso necessaria la determinazione precoce della vit...

Un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate

Arthritis is an inflammatory state within joints resulting in cartilage damage, pain, and loss of mobility. Recent advances in arthritis research ...

Le principali domande a cui vogliamo rispondere sono quali siano la risposta immunitaria sinoviale nativa agli stimoli infettivi e infiammatori e come ciò si rifletta nelle alterazioni della struttura sinoviale. Il mio principale obiettivo clinico e di ricerca è il trattamento di pazienti gravemente obesi con artrite RC in fase terminale. Spesso in questa popolazione di pazienti, sono stati trascurati dal punto di vista medico data la difficoltà di trovare opzioni di trattamento chirurgico per la loro malattia.Per iniziare, eseguire artrotomia e dissezione in sala operatoria. Utilizzare un approccio mediale parapatellare standard e eseguire un'esposizione più estensiva quando si opera su un paziente con obesità morbosa e artrosi in fase terminale. Identificare la sinovia anteriore e utilizzare l'elettrocauterio per dissezionare il tessuto.Osservare il ginocchio per segni di infiammazione, poiché i pazienti con obesità possono mostrare una risposta infiammatoria locale che si correla con gli effetti infiammatori più ampi dell'obesità. Passare la sinovia al membro del team di ricerca in modo sterile. Posizionare il contenitore del campione riempito con Dulbecco's PBS o DPBS freddo sul ghiaccio e trasferire il tessuto sinoviale anteriore umano acquisito durante l'artroplastica totale del ginocchio nel contenitore.Lavare il tessuto due volte in DPBS freddo per 10 minuti su una piastra rocker. Quindi, trasferire la sinovia in una provetta sterile da 10 centimetri o più grande sotto un armadio di livello di sicurezza biologica 2. Aggiungere DMEM sterile a basso glucosio con piruvato di sodio e L-glutamina per riempire la provetta a metà.Identificare il rivestimento sinoviale dal lato intimale perlaceo senza staccarlo. Organizzare gli strumenti necessari per ottenere campioni di biopsia di tre millimetri per un minimo di due repliche tecniche. Utilizzando forbici a iris o un bisturi, dissezionare il tessuto adiposo e stromale in eccesso dal lato cauterizzato per isolare la sinovia, mantenendo una profondità del tessuto di circa quattro-cinque millimetri in tutto.Cambiare il terreno della provetta se necessario per mantenere il campo visivo. Posizionare il tessuto con il rivestimento sinoviale rivolto verso lo strumento di prelievo. Stabilizzare il tessuto con la mano non dominante utilizzando pinze o emostatici e prelevare il tessuto applicando una pressione perpendicolare e una leggera torsione.Sostituire il punzone per biopsia dopo circa 10-15 usi o quando il tessuto si torce durante il prelievo per evitare di danneggiare la struttura dell'intima. Aprire una seconda provetta e riempirla con cinque-dieci millilitri di terreno contenente 10%FBS temperato a 37 gradi Celsius. Con pinze piatte o non dentate, trasferire i campioni nella provetta e agitare delicatamente per uno-due secondi per lavare via i detriti senza stringere troppo.Per preparare il pozzo inferiore del Sistema di Analisi dello Spazio Articolare, aggiungere 600 microlitri di DMEM a basso glucosio contenente 10%FBS temperato a 37 gradi Celsius. Aggiungere il controllo veicolo o il reagente di trattamento scelto, come LPS o MCP-1, al pozzo inferiore. Selezionare la dimensione del poro del transwell in base al risultato sperimentale desiderato e aggiungere 300 microlitri di DMEM a basso glucosio contenente 10%FBS al transwell.Utilizzando pinze sterili, trasferire delicatamente i singoli campioni di tessuto nel terreno del transwell, evitando campioni sfilacciati e galleggianti. Quindi, posizionare l'assieme in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5%di anidride carbonica per otto-72 ore a seconda dei saggi successivi da eseguire. Fissare il tessuto sinoviale in formalina tamponata neutra al 10%.Poi incastonarlo e sezionarlo per l'analisi istologica. Dopo aver colorato con ematossilina ed eosina, fotografare le sezioni di tessuto a 10X e 40X utilizzando microscopia a campo chiaro. Utilizzare Photoshop per delineare l'intima e le regioni subintimale nell'immagine TIFF 40X, mascherando aree non target, eritrociti e grande vascolarizzazione per la successiva analisi quantitativa.Analizzare le maschere finali per quantificare lo spessore, l'integrità e la cellularità dell'intima e del subintimal. Infine, valutare le cellule migratorie mediante citometria a flusso e i fattori solubili nel terreno raccolto mediante enzimatico-linked immunosorbent assay. Il tessuto sinoviale coltivato con dosi crescenti di MCP-1 o LPS ha mostrato distinti cambiamenti nella morfologia dell'intima, tra cui un'intima friabile e un'intima ispessita con una diminuzione della densità cellulare rispetto al controllo.Il trattamento con MCP-1 e LPS ha alterato la risposta citochinica sinoviale. MCP-1 ha indotto l'espressione del marcatore di fibroblasti patogeni podoplanina nel subintimal, mentre LPS ha aumentato la podoplanina sia nell'intima che nel subintimal. Le cellule immunitarie migratorie nel pozzo inferiore includevano neutrofili, cellule NK, cellule NKT, cellule T, cellule B o cellule dendritiche, monociti o macrofagi e macrofagi M2.Le cellule T erano le cellule immunitarie migratorie più abbondanti. Statisticamente, non c'era differenza nella migrazione cellulare basata sullo stimolo del pozzo inferiore. L'osteoprotegerina, una proteina rilevante per l'artrite, è stata rilevata a 24, 48 e 72 ore nel sinovio artritico non trattato e era significativamente più alta a 72 ore rispetto a 24 ore.L'espressione dell'ossido nitrico sintasi indotta nell'intima era elevata nei controlli a zero ore ed era quasi assente dopo 24 ore. L'espressione dell'ossido nitrico sintasi è stata mantenuta quando trattata con N-acetil cisteina. Al contrario, l'N-acetil cisteina non ha alterato l'espressione della metalloproteinasi-9, un marcatore sia della sinovite che del potenziale danno cartilagineo.Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare le alterazioni negli strati intimali e subintimali sinoviali, inclusa la profondità, la cellularità e l'integrità, che sono tutti indicativi di infiammazione. Le considerazioni più importanti durante l'esecuzione di questo protocollo sono l'acquisizione di tessuto vitale da donatori appropriati, la sterilità e l'identificazione dell'intima per la selezione della biopsia. Studi futuri valuteranno il miglioramento della durata della coltura del tessuto vitale per valutare la rigenerazione dell'intima sinoviale.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni murini intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare come osteoartrite, fattori genetici e/o i regimi differenti di carico influenzano la vulnerabilità dei condrociti in situ .

Visualizzazione in tempo reale e analisi di condrociti lesioni dovute a carichi meccanici in espianti di cartilagine murina completamente intatta

Qui, presentiamo un protocollo che descrive l'isolamento e la coltura di espiante cartilaginee dalle ginocchia bovine. Questo metodo fornisce uno strumento facile e accessibile per descrivere i cambiamenti dei tessuti in risposta a stimoli biologici o nuove terapie mirati all'articolazione.

Un modello di cultura del tessuto Ex Vivo di Cartilage Rimodellamento in Esplants bovina del ginocchio

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Forniamo metodi dettagliati per generare quattro tipi di tessuti da cellule staminali mesenchimali umane, che vengono utilizzate per ricapitolare la cartilagine, l'osso, il cuscinetto adiposo e la sinovia nell'articolazione del ginocchio umano. Questi quattro tessuti sono integrati in un bioreattore personalizzato e collegati attraverso la microfluidica, generando così un'articolazione del ginocchio su un chip.

Creazione di un ginocchio joint-on-a-chip per la modellazione delle malattie articolari e la sperimentazione di farmaci

Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall'osteoartrite.

Affrontare i problemi pratici nella microindentazione basata sulla microscopia a forza atomica su espianti di cartilagine articolare umana

Il presente studio fornisce un protocollo modificato per isolare i macrofagi sinoviali e i fibroblasti dal tessuto dell'artrite infiammatoria murina.

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Qui, presentiamo un sistema modello di assemblaggio per imitare il crosstalk cellulare tendineo tra il tessuto del nucleo tendineo portante e un compartimento estrinseco contenente popolazioni cellulari attivate da malattie e lesioni. Come importante caso d'uso, dimostriamo come il sistema possa essere implementato per sondare l'attivazione delle cellule endoteliali estrinseche rilevanti per la malattia.

Ingegnerizzazione di assiemi tendinei per sondare la diafonia cellulare nella malattia e nella riparazione

Qui, riportiamo un protocollo che stabilisce un modello murino di artrite reumatoide (RA) attraverso il trasferimento adottivo di cellule T CD4+ da topi SKG, fornendo uno strumento sperimentale rapido e affidabile per studiare i meccanismi immunologici, la progressione patologica e lo sviluppo di nuovi trattamenti per l'artrite reumatoide.

Un modello di trasferimento adottivo dell'artrite reumatoide nei topi

In questo articolo, descriviamo un metodo chirurgico per sezionare il legamento crociato anteriore (LCA) come un modello affidabile per indurre l'artrosi del ginocchio nei roditori e le metodologie per la raccolta del liquido sinoviale del ginocchio, la misurazione dell'edema del ginocchio e la valutazione della gravità dell'osteoartrite.

Transsezione del legamento crociato anteriore e lavaggio del liquido sinoviale in un modello di roditore per studiare l'infiammazione articolare e l'osteoartrite post-traumatica

Un nuovo metodo DC indipendente per l'induzione e l'espansione di antigene-specifica delle cellule T è descritta. HLA-A2 Ig Cellule artificiali basati Antigen Presenting (aAPC) vengono caricati con HLA-A2 peptidi limitato ad ampliare in modo efficace CTL di specificità antigenica diversi. Questa tecnologia ha un grande potenziale per CTL-immunoterapia adottiva.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

Scopri il sistema JSAS per modellare la sinovite umana ex vivo con architettura preservata. Questo metodo consente di studiare risposte acute a stimoli infiammatori e infettivi, mantenendo la funzionalità tissutale per la ricerca preclinica sull'artrite.

Un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate

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