Un metodo semplificato per la trasformazione mediata da agrobatteri di Phytophthora palmivora

Questo protocollo offre un sistema semplice, efficace e riproducibile per trasformare Phytophthora palmivora e Phytophthora capsici. Per cominciare, prendi una nuova piastra LB con coclea integrata con antibiotici. Aggiungi 20 microlitri di LB di mezzo liquido al centro della piastra e scava le cellule di agrobatterio da una piastra già cresciuta con un tubo sterile da 1,5 millilitri per microcentrifuga.

Utilizzando il fondo e la base piatta del tubo, distribuisci le celle uniformemente sulla piastra del pavimento. Incubare la piastra durante la notte a 28 gradi Celsius per circa 16-18 ore. Successivamente, scava le cellule dell'agrobatterio cresciute durante la notte usando una punta da un millilitro.

Risospendere le cellule in un millilitro di mezzo di induzione per agrobatterio pipettando su e giù. Ora, trasferire le cellule risospese in un tubo sterile da 50 millilitri coperto con carta stagnola e aggiungere un mezzo di induzione per agrobatterio. Misurare la densità ottica del campione a 600 nanometri e diluirlo con un mezzo di induzione per agrobatteri per ottenere una densità ottica di 0,4.

Poi allenta il coperchio del tubo coperto con la lamina che contiene la sospensione batterica. Posizionalo su un vibratore di piattaforma con una delicata agitazione a circa 70 giri al minuto. Inondare una piastra di phytophthora palmivora vecchia di sette o otto giorni con 10 millilitri d'acqua preraffreddata a quattro gradi Celsius.

Usa una punta di pipetta per tamburare delicatamente la superficie e rimuovere eventuali bolle d'aria sul substrato. Incubare il piatto a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Poi trasferiscilo a temperatura ambiente sotto luce per altri 15 minuti.

Utilizzando una pipetta, trasferisci delicatamente circa sette-otto millilitri di zoospore rilasciate in un tubo centrifuga sterile da 15 millilitri senza disturbare micelio e sporangi. Poi trasferisci 20 microlitri della sospensione zoospora in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungi 180 microlitri d'acqua per diluire la sospensione dieci volte tanto. Vortice il tubo per un minuto per insistere sulle zoospore e usa un emocitometro al microscopio per contare le zoospore.

Aggiungere cinque millilitri della sospensione agrobatterica preparata a cinque millilitri della sospensione zoospora in un tubo sterile rivestito con carta stagnola da 50 millilitri. Mescola delicatamente il contenuto, allenta il coperchio del tubo e lascialo riposare a temperatura ambiente per due ore. Durante l'incubazione, prepara le piastre AZCA.

Una volta che il mezzo si solidifica, applica un pezzo di membrana Hybond-N+ sterilizzato sulla piastra e tieni la piastra al buio. Dopo due ore di co-incubazione, si utilizza una punta di pipetta per distribuire 300 microlitri della miscela sulla membrana Hybond-N+, assicurandosi che i margini siano liberi dal liquido. Lascia le piastre di Petri scoperte nel cappuccio per circa 10 minuti per far asciugare la miscela all'aria.

Quando il liquido smette di muoversi sulla membrana, copri le piastre. Incubare le placche coperte a 25 gradi Celsius al buio per due giorni. Dopo 48 ore di incubazione, si utilizzano pinze sterilizzate per trasferire la membrana Hybond-N+a capovolta sulla piastra del coclea Plich senza trascinarla sulla superficie del cogliona.

Usa la base piatta di un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri per premere e scorrere delicatamente sulla superficie della membrana e garantire un pieno contatto con il mezzo. Controlla la parte inferiore della piastra per eventuali bolle d'aria e premi delicatamente con la stessa base piatta. Incubare la piastra a 25 gradi Celsius in un ciclo di luce di 12 ore e di 12 ore di buio per due o tre giorni.

Infine, dopo due o tre giorni di incubazione, rimuovere la membrana usando una pinza sterile e continuare a incubare la placca nelle stesse condizioni di luce e temperatura. La co-incubazione di zoospore di Phytophthora palmivora con l'agrobacterium tumefaciens EHA 105 che esprime pCB301TOR-GFP ha prodotto colonie resistenti a G418 su coclea Plich integrate con 30 microgrammi per millilitro di G418, mentre nessuna colonia è apparsa sulle piastre di controllo senza infezione da agrobatterio. Il numero di trasformanti resistenti al G418 ogni 10 a potenza di sette zoospore era di 55 nel primo esperimento e di 50 nel secondo esperimento.

La microscopia a fluorescenza ha confermato un segnale proteico fluorescente verde chiaro nei trasformanti di Phytophthora palmivora. Inoltre, questo protocollo è stato applicato a phytophthora capsici per generare con successo trasformanti che esprimono GFP. Il nostro protocollo consente ai ricercatori di studiare le funzioni geniche, determinare la localizzazione cellulare delle proteine e monitorare la dinamica delle infezioni da patogeni.

Questi protocolli possono generare una bassa percentuale di falsi positivi e quindi richiedono approcci aggiuntivi per confermare i veri trasformanti. L'applicazione di questo sistema di trasformazione può essere estesa ad altri omiceti e funghi. Cercheremo inoltre di semplificare ulteriormente questo protocollo in futuro.