Una piattaforma innovativa per lo stretching e l'imaging cellulare in vitro

Il nostro obiettivo era sviluppare un dispositivo di allungamento cellulare compatibile con un microscopio ispirato a basso costo a un microscopio Hoberman, per indagare come lo stiramento meccanico influenzi la funzione cellulare. Questo dispositivo permette ai ricercatori di studiare le risposte delle cellule vitali a stimoli meccanici, imitando sistemi fisiologici come il battito cardiaco o la respirazione dei polmoni. Per iniziare, dove appropriato, l'equipaggiamento di protezione individuale.

Mescola la base Silgard 184 e l'agente di polimerizzazione in un rapporto 10 a uno in una teglia di plastica. Con un depressore linguale mescola vigorosamente i componenti per due o tre minuti. Poi metti il piatto in una camera di degassaggio per un'ora.

Poi, prendi gli stampi stampati in 3D preparati e aggiungi 1,3 grammi della miscela PDMS nello stampo isotropo. Poi aggiungi 0,5 grammi della miscela PDMS allo stampo uniassiale. Distribuisci il gel uniformemente sullo stampo e degasa lo stampo riempito per un'ora.

Lascia sedimentare il gel nello stampo su una superficie piana a temperatura ambiente per due ore. Poi polimerizza la muffa in forno a 60 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, mescola le parti A e B del gel NuSil 8100 in proporzioni uguali.

Mescola il gel combinato con il crosslinker Silgard 184 allo 0,36% del volume totale per ottenere una rigidità del substrato di 13 kilopascal. Per ottenere un substrato morbido con una rigidità di 0,3 kilopascal, evita l'aggiunta del crosslinker, poi mescola la soluzione per 15 minuti. Mettere la miscela NuSil in una camera di degassaggio e degassare per 30 minuti.

Ora rimuovi con attenzione il gel PDMS dallo stampo personalizzato e posizionalo su un copricapo da 40 millimetri senza strapparlo. Poi inserisci il gel PDMS nello spin coder. Pipetta 100 microlitri della miscela NuSil sull'area negativa del gel isotropo PDMS.

Poi pipetta 50 microlitri della miscela NuSil sull'area negativa del gel uniassiale PDMS. Dopo quel codice a sette G per 50 secondi. Per raggiungere uno spessore di 100 micrometri.

Lascia sedimentare il gel rivestito su una superficie piana a temperatura ambiente per due ore. Metti il gel in forno e polimerizza a 60 gradi Celsius durante la notte. Ora seminano le vie aeree umane, le cellule muscolari lisce nei pozzi di coltura elastica e si incubano in condizioni standard.

Successivamente, mescola le cellule con la soluzione di calcio FLIPR Calcium six per l'imaging. Per la misurazione della forza di trazione, rivestire i substrati del gel NuSil del PDMS con uno strato di perle fluorescenti che fungano da marcatori fiduciali. Prepara una soluzione allo 0,025% di microsfere rosse fluorescenti carbossilate modificate di un micrometro in HBSS.

Utilizzando un miscelatore a vortice, si fa lavorare la soluzione per 10 secondi. Poi pipetta 880 microlitri della soluzione della perla nel gel isotropo. Aggiungi 420 microlitri della soluzione a sfera al gel uniassiale.

Dopo aver incubato il gel a temperatura ambiente per un'ora, rimuovere con cura la soluzione di perle per preservare la distribuzione delle perline. Poi usa un cotton fioc o una salvietta da laboratorio per tamponare delicatamente eventuali residui dalla superficie del gel. Successivamente, usa un microscopio rovesciato dotato di una macchina fotografica, motore leggero e un obiettivo 10 x asciutto.

Imposta l'eccitazione a 475 per 40 nanometri e l'emissione a 555 per 50 nanometri. Acquisire immagini a 16 bit a un frame rate di due hertz durante esperimenti di stretching. Ora posiziona il gel isotropo sulla barella e poi immagini le sfere fluorescenti usando un microscopio rovesciato dotato di un obiettivo asciutto 10 volte. Cattura immagini in condizioni pre-stretching.

Cattura continuamente immagini durante tutto il protocollo di allungamento al centro del substrato. Se necessario, rifocalizza il microscopio nella posizione allungata prima di catturare le immagini. Analizza le immagini utilizzando codice MATLAB personalizzato basato sulla microscopia della forza di trazione di Furier per calcolare i vettori di spostamento e i corrispondenti campi di deformazione planari.

Rappresenta i dati come media degli studi finali. Applicando uno spostamento di 240 micrometri, le sfere fluorescenti si spostavano radialmente verso l'esterno dal centro. La microscopia della forza di trazione ha rivelato un campo di spostamento isotropo con vettori che si irradiano dal centro e aumentano di magnitudo con la distanza.

Il campo di spostamento isotropo generava un campo di deformazione planare omogeneo. Aumentare lo spostamento a 1000 micrometri ha prodotto vettori di spostamento che aumentavano di magnitudo mantenendo l'orientamento radiale. Il corrispondente campo di deformazione a 1000 micrometri è aumentato di magnitudine pur rimanendo radialmente simmetrico.

Nei gel uniassiali sottoposti a uno spostamento di 250 micrometri, i vettori di spostamento erano prevalentemente allineati lungo un unico asse, coerente con la deformazione uniassiale. Le forme d'onda di deformazione rispecchiavano da vicino gli spostamenti motori programmati e rimanevano sincronizzate su tre cicli ripetuti. I valori di deformazione al massimo spostamento sono rimasti costanti su tre campioni indipendenti.

Applicando uno spostamento transitorio fino a 5.555 micrometri si producevano tensioni che variavano da oltre lo 0,1% al 12%. Una deformazione transitoria dello 0,5% induceva un aumento del calcio intracellulare, evidente come maggiore intensità di fluorescenza dopo lo stretching. Utilizzando la nostra barella, i ricercatori possono effettuare imaging di calcio a cellule vive, microscopia della forza di trazione e quantificare le risposte meccaniche cellulari all'allungamento isotropo o uniassiale. Un passaggio fondamentale è assicurarsi che i gel si induriscano su una superficie piana, poiché uno spessore irregolare può spostare il substrato fuori fuoco e ridurre la chiarezza ottica durante l'imaging dal vivo.

Studi futuri potranno indagare la riorientazione del citoscheletro indotta dallo stiramento, condizioni patologiche da sforzo rilevanti per l'asma o le lesioni polmonari, e su diversi tipi cellulari.