Modulazione colinergica dipendente dal ligando dell'accoppiamento fosforilazionale ossidativo nelle cellule neuroblastoma BE(2)-C permeabilizzate dalla digitonina

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare un metodo per valutare la bioenergetica mitocondriale in cellule di neuroblastoma coltivate intate, utilizzando la permeabilizzazione selettiva e la combinazione di inibitori del substrato. Tradizionalmente, la respirazione mitocondriale viene valutata utilizzando strumenti come il respirometro ad alta risoluzione Oroboros O2K, l'elettrodo dell'ossigeno di tipo Clark e l'analizzatore Seahorse XF. I metodi tradizionali che si basano su frazioni mitocondriali isolate o arricchite da tessuti o cellule spesso compromettono la struttura mitocondriale.

Ad esempio, questa immagine al microscopio elettronico a trasmissione dei mitocondri isolati dalla corteccia del topo rivela un netto contrasto nell'integrità strutturale a seconda che i mitocondri siano incapsulati o meno nei terminali presinaptici. I mitocondri che rimangono incapsulati nelle terminali pre-sinaptiche appaiono strutturalmente intatti, come indicato dalle frecce ciano in questa immagine. Al contrario, i mitocondri non incapsulati o privi di struttura membranosa circostante spesso appaiono deformi, come rappresentato dalle frecce gialle.

L'analizzatore Seahorse Flex è comunemente utilizzato per studiare la bioenergetica mitocondriale sia in cellule coltivate che in mitocondri isolati. Nell'analisi basata su cellule coltivate, l'architettura cellulare e le reti di segnalazione sono preservate. Tuttavia, la membrana plasmatica delle cellule intatte è impermeabile a molti substrati del ciclo dell'acido tricarbossilico.

Questo limita l'ambito dell'analisi metabolica rispetto ai mitocondri isolati, che non hanno una barriera plasmanica ma spesso mostrano artefatti strutturali. Pertanto, entrambi i sistemi hanno limitazioni intrinseche. La tecnica presentata qui sfrutta il fatto che la membrana plasmatica è ricca di colesterolo, mentre la membrana mitocondriale ne contiene pochissimo.

Utilizzando un detergente che lega il colesterolo come la digitonina, possiamo permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica lasciando intatta la membrana mitocondriale. Questo approccio consente l'ingresso controllato di substrati mitocondriali e inibitori nella cellula senza compromettere l'integrità degli organelli. Pertanto, questa tecnica consente l'analisi funzionale dei mitocondri nel contesto di cellule intatte, combinando il vantaggio dell'architettura cellulare intera con l'accessibilità di saggi mitocondriali isolati.

Inizia l'esperimento con una piattaforma di coltura sub-confluente delle tue cellule. Lavare delicatamente le cellule con un tampone sterile a fosfato. Aggiungi un volume appropriato di soluzione di Triton per coprire uniformemente il monostrato cellulare. Dopo l'incubazione, rimuovi la ciotola e tocca o scuoti delicatamente orizzontalmente per aiutare a staccare le cellule.

Utilizzando una pipetta da cinque ml e un controller pipetta, pipetta la sospensione della cella su e giù più volte per rompere qualsiasi grumo e ottenere una sospensione a singola cella. Esaminare la sospensione cellulare al microscopio per confermare una sospensione uniforme a singola cellula. Contare le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.

Regolare la concentrazione cellulare in modo che 100 microlitri della sospensione contenga circa 10.000 cellule. Velocizza con attenzione 100 microlitri della sospensione a celle in ogni pozzo della piastra di analisi Seahorse XF. Lasciane uno ben vuoto per servire come controllo di sfondo durante il test.

Incubare la piastra in un incubatore di colture cellulari per due o tre ore per permettere alle cellule di aderire al fondo del pozzo. Una volta attaccate le cellule, aggiungi delicatamente 300 microlitri di mezzo per il saggio in ciascun pozzo. Riportare la piastra nell'incubatrice e incubare durante la notte per permettere alle cellule di stabilizzarsi e crescere.

Assicurarsi che le celle formino uno strato monostrato uniforme sul fondo di ogni pozzo. Evita il sovraffollamento. Le celle dovrebbero essere confluenti, ma non sovraconfluenti, per garantire una performance ottimale del saggio.

La sera prima dell'esperimento, idratare la cartuccia sensore XFp 24 aggiungendo un ml di buffer di calibrazione a ciascun pozzo. In alternativa, puoi usare soluzione salina tamponante fosfato, pH 7,4. Lascia la cartuccia a temperatura ambiente tutta la notte sul letto.

L'incubazione in un incubatore non COT a 37 gradi centigradi non è necessaria poiché la cartuccia si equilibrerà alla temperatura ambiente durante il processo di caricamento. Chiama tutte le soluzioni di stock congelato e il buffer di 2 microgliali a temperatura ambiente. Controlla il pH, dovrebbe essere 7,4.

Aggiusta se necessario. Prepara tutto il substrato e le soluzioni iniettabili e verifica nuovamente il pH. Tieni tutte le soluzioni sul ghiaccio fino all'uso.

Prepara tubi alimentari etichettati con A, B, C e D per le soluzioni di porta di iniezione della cartuccia sensore. È meglio preparare soluzioni contenenti i rispettivi inibitori o substrati per ogni porta. Utilizzando una pipetta multicanale, carica con attenzione 50 microlitri di ciascuna soluzione di porte di iniezione nelle rispettive porte, da A a D.

Avviare il bioanalizzatore Seahorse una o due ore prima dell'esperimento per permettere all'incubatore interno di stabilizzarsi a 37 gradi centigradi. Etichetta ogni pozzo e raggruppa il tuo disegno sperimentale e le linee guida di Wave Desktop 2.6. Programmare il bioanalizzatore per la miscela, il peso e il ciclo di misura appropriati.

Vedi la tabella 8 per riferimento. È importante disabilitare l'opzione di equilibrio all'inizio del ciclo di misura. Tenerlo prolungherà inutilmente l'esperimento e potrebbe esaurire i substrati.

Avvia la macchina prima calibrerà la cartuccia sensore, il che richiede circa 15 minuti. Inizia a preparare la piastra cellulare subito dopo aver messo la cartuccia sensore in calibrazione. Aspirare attentamente il tampone senza disturbare le cellule a circa 700 microlitri di tampone mitocondriale 1x su ciascun pozzo con cellule aderenti, e lasciare che la piastra riposi per un minuto per stabilizzarsi.

Aspirare con cura il tampone da ogni pozzo senza disturbare le celle aderenti. Ripeti il passaggio della lavatrice tre volte per assicurarti un mezzo completo. In parallelo, aggiungere 50 microlitri di tampone per analisi mitocondriali a un pozzo di fondo senza cellule.

Usa il menisco come riferimento visivo per la coerenza del volume. Aspirare con cura il tampone dai pozzi contenenti la cellula, lasciando circa 50 microlitri per mantenere l'idratazione cellulare. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, o in un bagno d'acqua, mantenendola sopra la superficie dell'acqua, o in un incubatore non in acciaio con l'atmosfera satura per evitare l'evaporazione.

Poco prima di caricare nell'analizzatore, aggiungere 450 microlitri di tampone per il test mitocondriale preriscaldato contenente substrati, inibitori o farmaci secondo necessità in ciascun pozzo, portando il volume totale a 500 microlitri. La piastra è ora pronta per eseguire il test utilizzando la cartuccia sensore calibrata nel bioanalizzatore Seahorse. Per prima cosa, eseguiamo un saggio di accoppiamento per esaminare il grado di accoppiamento tra il sistema di trasporto elettronico e la fosforilazione ossidativa.

Il saggio di accoppiamento aiuta a distinguere la funzione mitocondriale dalla disfunzione. In questo diagramma del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriali, mostriamo che gli inibitori specifici complessi uno, tre e cinque insieme ai nodi per diversi substrati come piruvato o malato e succinato donano gli elettroni al sistema. Questa visualizzazione è utile per comprendere come funziona il saggio e il ruolo dei vari substrati e inibitori.

Esaminiamo innanzitutto due diverse concentrazioni di digitonina, cinque micromolari e dieci micromolari, per la loro efficacia nel facilitare il trasporto degli elettroni attraverso la membrana plasmatica e nel consentire il saggio di accoppiamento. In questo saggio, il livello di accoppiamento respiratorio è stato valutato misurando sequenzialmente il tasso di consumo di ossigeno in presenza di succinato come substrato e rotenone come inibitore complesso uno. ADP, oligomicina, FCCP e antimicina A sono stati poi iniettati in sequenza, e le misurazioni OCR sono state registrate dopo ogni iniezione.

Il pannello di sinistra mostra grafici lineari che mostrano la cinetica della tensione dell'ossigeno all'interno della microcamera transitoria. Tipicamente, questo valore dovrebbe rimanere tra 100 e 200 millimetri di mercurio per garantire la rilevazione all'interno dell'intervallo dinamico del sensore. Questi set di dati sono stati generati utilizzando la modalità punto a punto nel software Agilent Wave, che mostra l'OCR come una serie di velocità durante il periodo di misura, permettendo la visualizzazione dei cambiamenti dinamici, in particolare 10 micromolari digitonine aumentato il trasporto di succinato rispetto a cinque micromolari, con conseguente riduzione della tensione di ossigeno nella microcamera e, di conseguenza, maggiore assorbimento di ossigeno.

Tracciando i dati ottenuti da questi esperimenti, si è rivelato che la respirazione basale mediata dai complessi da due a quattro era significativamente più alta a 10 micromolari di digitonina rispetto a cinque micromolari, indicando un trasporto più efficiente delle succinate attraverso la membrana plasmatica permeabilizzata a concentrazioni più elevate. Sulla base di questa osservazione, e dato che 10 micromolari di digitonina fornivano una permeabilizzazione ottimale, abbiamo successivamente ridotto il numero cellulare a 20.000 cellule per pozzo per abbassare la respirazione basale. Questa regolazione ha garantito che qualsiasi potenziamento respiratorio indotto da farmaci o substrati rimanesse entro il range dinamico di rilevamento del sistema.

Una volta ottimizzata la concentrazione di digitonina e il numero cellulare, è stato condotto il successivo saggio di accoppiamento per valutare gli effetti degli agonisti muscarinici e degli antagonisti sulla respirazione mitocondriale. Una scoperta importante di questo insieme di esperimenti è stata che nelle cellule digitonine non trattate, la respirazione basale mediata da complessi guidati da succinato da due a quattro così come da una respirazione di Stato 3 e Stato 3U è stata significativamente ridotta. Ciò indica che il succinato non è stato trasportato nella cellula in condizioni non permeabilizzate.

La traccia dei dati di molteplici esperimenti indipendenti ha rivelato che l'antagonista muscarinico atropina ha ridotto significativamente la respirazione basale mediata da complessi due a quattro nelle cellule neuroblastomatiche rispetto all'agonista muscarinico acetilcolina, che ha mantenuto un alto livello di respirazione. Inoltre, sia la respirazione di Stato 3 che di Stato 3u sono risultate significativamente inferiori nelle cellule non permeabilizzate rispetto a quelle permeabilizzate, sottolineando l'efficacia della digitonina nel permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica senza compromettere la funzione mitocondriale. Il saggio sul flusso elettronico valuta il trasferimento sequenziale degli elettroni alla catena di trasporto mitocondriale, aiutando a identificare i meccanismi di disfunzione o modulazione mitocondriale.

Nella fase iniziale del saggio, le cellule sono state trattate con piruvato, malato e FCCP, che hanno indotto un alto livello di respirazione non accoppiata causata dai complessi uno a quattro. L'aggiunta successiva di rotenone ha inibito il complesso uno, riducendo la respirazione basale e isolando l'attività del complesso due a quattro. Sebbene non abbiamo osservato differenze significative tra le condizioni trattate da farmaci e quelle di controllo, un'osservazione importante è stata che la respirazione statale-3u guidata dalle succinate era significativamente più bassa nelle cellule non permeabilizzate, indicando il ruolo critico della digitonina che consente l'ingresso della succinata nella cellula.

In sintesi, questo protocollo offre un modo affidabile per studiare la bioenergetica mitocondriale. Combina la rilevanza fisiologica dell'architettura cellulare intera con la precisione di saghi mitocondriali isolati, consentendo la consegna controllata di substrati e inibitori preservando l'integrità degli organelli. Ottimizzando la concentrazione di digitonina e la densità cellulare, i ricercatori possono ottenere misurazioni accurate e riproducibili.

Questo approccio adattabile è ideale per esplorare la modulazione mediata dai recettori della funzione mitocondriale e fornisce una potente piattaforma per la ricerca sulle malattie e la scoperta di farmaci.