Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4
17 aprile 2026
Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq rapido e semplice da implementare nel verme intero Caenorhabditis elegans a stadio L4 utilizzando solo 30 μL di pellet di verme.
La nostra ricerca si concentra su come la regolazione epigenetica modella l'espressione genica, in particolare su come l'accessibilità della cromatina controlla l'attività genica in diverse condizioni biologiche. L'ATAC-seq in C. elegans è limitato dal suo cuticolo protettivo. I nostri protocolli superano questa barriera per consentire un'analisi affidabile dell'accessibilità della cromatina.
Per iniziare, otterrai una popolazione sincrona di vermi L1 e permetterai loro di crescere per 26 ore a 20 gradi Celsius. Conferma al microscopio che la maggior parte dei vermi è nello stadio L4. Recupera tutti i vermi dai piatti con tampone M9 e trasferiscili in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.
Lavati i vermi cinque volte con un millilitro di acqua sterile lasciandoli sedimentare per gravità. Quindi, trasferisci il tubo contenente i vermi in un incubatore a 25 gradi Celsius per 30 minuti per rimuovere i resti di cibo intestinale. Quindi prendi 50 microlitri del pellet di vermi e mettilo in un nuovo tubo.
Per lisare i vermi, aggiungi 200 microlitri di tampone fresco SDS-DTT e mescola in un rotatore di tubi per esattamente cinque minuti. Quindi, aggiungi un millilitro di tampone per uova freddo. Quindi centrifuga su un picofuge per rimuovere il surnatante e ripeti sei volte.
Dopodiché, aggiungi 80 microlitri di pronasi appena preparato. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri con punte filtrate, mescola la miscela di pronasi e vermi 70 volte e incubala a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungi 800 microlitri di mezzo L15 con siero bovino fetale al 10% e centrifuga a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la rimozione del surnatante, aggiungi un millilitro di mezzo L15 con siero bovino fetale al 10% e centrifuga come dimostrato in precedenza. Una volta che il pellet è stato lavato tre volte, rimuovi il surnatante e resuspendi il pellet in 900 microlitri di mezzo L15 con siero bovino fetale al 10%. Quindi filtra la sospensione utilizzando un filtro da 20 micrometri.
Centrifuga la sospensione cellulare filtrata a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovi il surnatante, lasciando circa 50 microlitri. Aggiungi 45 microlitri di tampone di lisi appena preparato e resuspendi accuratamente il campione.
Quindi aggiungi con attenzione 50 microlitri di tampone di lavaggio senza mescolare il campione. Centrifuga a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovi il surnatante e mantieni il campione sul ghiaccio.
Mentre centrifughi, prepara il mix TN5 per campione combinando 25 microlitri di tampone TN5, 24,8 microlitri di acqua priva di nucleasi e 0,2 microlitri di enzima TN5. Dopo la centrifugazione, rimuovi il surnatante e mantieni i nuclei sul ghiaccio. Aggiungi 50 microlitri di mix TN5 al pellet nucleare.
Quindi pipetta su e giù sette volte per mescolare. Incuba a 37 gradi Celsius per 30 minuti su un blocco termico e batti delicatamente il tubo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione con TN5, aggiungi 300 microlitri di tampone PB e mescola facendo vibrare alla massima velocità per 25 secondi.
Trasferisci l'intero volume dal tubo alla colonna di centrifugazione. Centrifuga a temperatura ambiente per un minuto alla massima velocità. Aggiungi 750 microlitri di tampone PE alla colonna di centrifugazione e centrifuga nuovamente.
Quindi scarica il surnatante con il tubo di raccolta. Dopo una centrifugazione vuota, posiziona la colonna in un nuovo tubo da 1,5 millilitri etichettato. Aggiungi 10 microlitri di tampone EB a 37 gradi Celsius al centro della colonna senza toccarla.
Lascialo a temperatura ambiente per un minuto. Quindi centrifuga per un minuto alla massima velocità a temperatura ambiente. Quindi ripeti i passaggi di eluizione per ottenere un volume finale di 20 microlitri in tampone EB.
Esegui una PCR in tempo reale per stimare il numero di amplificazione del ciclo appropriato per l'amplificazione della libreria ATAC. Stima il numero di cicli di amplificazione finale selezionando il ciclo in cui il segnale di amplificazione raggiunge 1/3 del suo massimo per ciascun campione. Esegui l'amplificazione finale per la libreria ATAC e assegna un primer inverso diverso a ciascun campione e registralo.
Amplifica ogni campione per il numero di cicli stimato per quel campione. Esegui la reazione a catena della polimerasi presentata in tubi da 200 microlitri utilizzando 10 microlitri di libreria di DNA in un volume totale di reazione di 50 microlitri. Conserva i campioni a meno 20 gradi Celsius se si interrompe il protocollo.
Dopo aver purificato la libreria amplificata, esegui l'elettroforesi capillare per vedere il pattern di distribuzione della dimensione del frammento. La curva di amplificazione che risulta in una stima finale di amplificazione della libreria di meno di 15 cicli indica materiale di buona qualità adatto per la continuazione. La curva di amplificazione che mostra un aumento ritardato indica materiale di scarsa qualità e non dovrebbe essere continuata.
La distribuzione della lunghezza del frammento dopo l'amplificazione ha mostrato pattern nucleosomiali a circa 150 paia di basi e 300 paia di basi nei campioni validi. Un pattern di frammenti sfumato indicava DNA sovra-tagmentato che richiedeva la ripetizione del campione. Il nostro protocollo consentirà la profilazione dell'accessibilità della cromatina su larga scala in vermi interi per comprendere come gli ambienti influenzano la regolazione genica.
La sfida chiave è bilanciare l'input dei vermi e l'attività TN5 per evitare una tagmentazione insufficiente o eccessiva, garantendo una profilazione ottimale dell'accessibilità della cromatina. Questo approccio apre opportunità per studiare la variazione epigenetica attraverso isolati selvatici, condizioni ambientali e persino specie alternative.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) in vermi interi di Caenorhabditis elegans allo stadio di sviluppo L4. Il metodo supera le difficoltà poste dalla cuticola ricca di collagene del nematode, consentendo un profilo efficiente dell'accessibilità della cromatina a livello genomica con un numero minimo di cellule. Il flusso di lavoro semplificato facilita lo studio della dinamica della cromatina in risposta a cambiamenti genetici e ambientali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Genomica
- Epigenetica
- Biologia Molecolare
Sfondo
- L'accessibilità della cromatina è fondamentale per la trascrizione, la riparazione del DNA e la segregazione dei cromosomi.
- Le regioni di cromatina iper-accessibili sono associate a promotori e potenziatori attivi.
- L'ATAC-seq consente la mappatura su scala genomica delle regioni di cromatina accessibili utilizzando un numero ridotto di cellule.
- L'implementazione in C. elegans è difficoltosa a causa della cuticola di collagene particolarmente resistente dell'organismo.
Scopo dello studio
- Sviluppare e presentare un protocollo ottimizzato di ATAC-seq per vermi interi di C. elegans.
- Permettere un profilo efficiente della accessibilità della cromatina allo stadio L4.
- Ridurre le barriere tecniche per l'ATAC-seq in questo organismo modello.
Metodi Utilizzati
- Cultura sincronizzata di C. elegans allo stadio L4.
- Alterazione della cuticola e dissociazione enzimatica per ottenere sospensioni cellulari.
- Preparazione di nuclei permeabilizzati per la transposizione Tn5.
- Amplificazione mediante PCR e purificazione di librerie pronte per il sequenziamento di nuova generazione (NGS).
Risultati principali
- Il protocollo richiede soltanto 30 μL di pellet di vermi.
- L'intero flusso di lavoro può essere completato in un solo giorno.
- Genera da 5.000 a 9.000 picchi di accessibilità della cromatina nel ceppo di riferimento Bristol N2.
- Il metodo è adattabile ad altri stadi di sviluppo o a popolazioni cellulari purificate mediante FACS.
Conclusioni
- Questo protocollo ATAC-seq ottimizzato consente un'analisi robusta della accessibilità della cromatina in vermi interi di C. elegans.
- Amplia le opportunità per studiare la dinamica della cromatina a livello del genoma in risposta a diverse perturbazioni.
- Il flusso di lavoro semplificato riduce le barriere tecniche per i ricercatori che utilizzano questo organismo modello.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Il profiling dell'accessibilità della cromatina a livello del genoma in larve L4 intere di Caenorhabditis elegans permette un'analisi diretta dei paesaggi regolatori in un organismo multicellulare integro. Questo protocollo ATAC-seq ottimizzato riduce le barriere tecniche, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva negli studi sulla regolazione genica e facilitando la riduzione dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta. L'adattabilità del protocollo aumenta il suo valore per la validazione degli obiettivi su larga scala e per iniziative di genomica funzionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette la mappatura ad alta risoluzione delle regioni di cromatina accessibile per la validazione funzionale di target.
- Supporta la riduzione dei rischi meccanicistici rivelando l'attività di elementi regolatori in un contesto di organismo intero.
- Facilita l'interrogazione guidata da ipotesi sulle reti regolatorie geniche rilevanti per i modelli di malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un flusso di lavoro standardizzato per generare dati riproducibili di accessibilità della cromatina da piccoli campioni in ingresso.
- Fornisce risultati quantitativi di picchi adatti per analisi comparative tra diverse condizioni genetiche o ambientali.
- Prepara sistemi biologici validati per analisi successive di perturbazioni regolatorie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette la valutazione della dinamica della cromatina in risposta a perturbazioni genetiche o ambientali in un modello rilevante per la malattia.
- Consente un approccio continuo dalla scoperta alla validazione preclinica, collegando i cambiamenti regolatori agli esiti fenotipici.
- Offre una piattaforma per l'identificazione di biomarcatori traslazionali dello stato della cromatina, quando supportata da studi aggiuntivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo ATAC-seq si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale del target fino alla ricerca preclinica, consentendo un'analisi robusta della cromatina in organismi interi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mappando gli elementi regolatori accessibili.
- Screening: Fornisce dati quantitativi e riproducibili sull'accessibilità della cromatina per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Genera conteggi di picchi e profili su scala genomica per confrontare gli stati regolatori in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'indagine dei cambiamenti della cromatina associati a perturbazioni rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Un flusso di lavoro adattabile supporta un'ampia applicazione attraverso le diverse fasi di sviluppo e popolazioni cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sui meccanismi regolatori e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Semplifica il profilo della cromatina con un protocollo scalabile in un solo giorno che richiede una quantità minima di materiale iniziale.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione fornendo dati epigenomici solidi e riproducibili.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione degli obiettivi e dei percorsi in base alle evidenze di accessibilità della cromatina, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di nematodi, nella dissociazione cellulare e nella preparazione di librerie per sequenziamento di nuova generazione (NGS).
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per il sequenziamento di nuova generazione e a supporto di bioinformatica per l'analisi dei dati.
- La standardizzazione tra i gruppi di lavoro è essenziale per la riproducibilità e la confrontabilità tra studi.
- Il protocollo è adattabile ad altri stadi di sviluppo o a popolazioni cellulari purificate mediante FACS, secondo le esigenze.
- Possono sorgere limitazioni tecniche legate alla dimensione dell'input del campione o all'efficienza di interruzione della cuticola.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Isolation and Dissociation of Caenorhabditis elegans into Single-Cell Suspension
2:47
Nuclei Isolation and Chromatin Tagmentation for ATAC Sequencing
5:25
ATAC Library Amplification and Cycle Optimization Using qPCR
6:36
Results
7:25
Conclusion
