Name: Profilazione dellaccessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara il protocollo ATAC-seq ottimizzato per Caenorhabditis elegans allo stadio L4. Questo metodo supera la barriera della cuticola ricca di collagene, consentendo il profilo dell'accessibilità cromatinica con pochi campioni.

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<ol><li>Poulet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+histones+in+Physarum+polycephalum+evidence+a+phylogenetic+vicinity+of+mycetozoans+to+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genom.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom.</a> NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>250 mL, 0.22 &micro;m PES</td><td>Ultra Curz</td><td>sc-200253</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPURE XP</td><td>Nalgene</td><td>A63886</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Maplica</td><td>200100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 20 &micro;m</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2315</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141-500 mg</td><td></td></tr><tr><td>Disposable gloves</td><td>Microflex</td><td>94-243</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>sigma</td><td>D0632-10G</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, pure</td><td>Sigma</td><td>1003661421</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>biowest</td><td>S181S-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)</td><td>Illumina</td><td>20034211</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Syber 50 mL</td><td>Sigma</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leivobitz)</td><td>sigma</td><td>L4386-10L</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride anhydrous</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit (50 preps)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext&reg; High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma</td><td>74835-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm</td><td>Tritech</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 90 mm</td><td>Interlux</td><td>C9015-2C</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 10 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800108</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 20 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800708</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800608</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541 -500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic Powder</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic, Crystal</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-01 500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>JT Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>sigma</td><td>L4509-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hypochlorite</td><td>Cloralex</td><td>544394479</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated Crystal</td><td>J.T. Baker</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter PVDF 0.22 &micro;m</td><td>Ultra Curz</td><td>Sc-358812</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503 1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di caenorhabditis elegans l4

Chromatin Accessibility Profiling in Whole Caenorhabditis elegans L4 Larvae

Il controllo qualità dopo la tagmentazione garantisce una preparazione accurata della libreria Durante il protocollo, è importante prestare particolare attenzione alla qPCR eseguita dopo la marcatura della cromatina (sezione 9), poiché rappresenta un passaggio fondamentale per valutare la qualità del DNA e le prestazioni dell'esperimento. La Figura 1A mostra due curve di amplificazione; Quella sinistra (sotto i 15 cicli) rappresenta materiale di buona qualità che dimostra...

Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4

Chromatin accessibility plays essential roles in transcription, DNA repair, and chromosome segregation. Hyper-accessible regions usually correlate with ...

La nostra ricerca si concentra su come la regolazione epigenetica modella l'espressione genica, in particolare su come l'accessibilità della cromatina controlla l'attività genica in diverse condizioni biologiche. L'ATAC-seq in C. elegans è limitato dal suo cuticolo protettivo. I nostri protocolli superano questa barriera per consentire un'analisi affidabile dell'accessibilità della cromatina.Per iniziare, otterrai una popolazione sincrona di vermi L1 e permetterai loro di crescere per 26 ore a 20 gradi Celsius. Conferma al microscopio che la maggior parte dei vermi è nello stadio L4. Recupera tutti i vermi dai piatti con tampone M9 e trasferiscili in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.Lavati i vermi cinque volte con un millilitro di acqua sterile lasciandoli sedimentare per gravità. Quindi, trasferisci il tubo contenente i vermi in un incubatore a 25 gradi Celsius per 30 minuti per rimuovere i resti di cibo intestinale. Quindi prendi 50 microlitri del pellet di vermi e mettilo in un nuovo tubo.Per lisare i vermi, aggiungi 200 microlitri di tampone fresco SDS-DTT e mescola in un rotatore di tubi per esattamente cinque minuti. Quindi, aggiungi un millilitro di tampone per uova freddo. Quindi centrifuga su un picofuge per rimuovere il surnatante e ripeti sei volte.Dopodiché, aggiungi 80 microlitri di pronasi appena preparato. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri con punte filtrate, mescola la miscela di pronasi e vermi 70 volte e incubala a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungi 800 microlitri di mezzo L15 con siero bovino fetale al 10% e centrifuga a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la rimozione del surnatante, aggiungi un millilitro di mezzo L15 con siero bovino fetale al 10% e centrifuga come dimostrato in precedenza. Una volta che il pellet è stato lavato tre volte, rimuovi il surnatante e resuspendi il pellet in 900 microlitri di mezzo L15 con siero bovino fetale al 10%. Quindi filtra la sospensione utilizzando un filtro da 20 micrometri.Centrifuga la sospensione cellulare filtrata a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovi il surnatante, lasciando circa 50 microlitri. Aggiungi 45 microlitri di tampone di lisi appena preparato e resuspendi accuratamente il campione.Quindi aggiungi con attenzione 50 microlitri di tampone di lavaggio senza mescolare il campione. Centrifuga a 500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovi il surnatante e mantieni il campione sul ghiaccio.Mentre centrifughi, prepara il mix TN5 per campione combinando 25 microlitri di tampone TN5, 24,8 microlitri di acqua priva di nucleasi e 0,2 microlitri di enzima TN5. Dopo la centrifugazione, rimuovi il surnatante e mantieni i nuclei sul ghiaccio. Aggiungi 50 microlitri di mix TN5 al pellet nucleare.Quindi pipetta su e giù sette volte per mescolare. Incuba a 37 gradi Celsius per 30 minuti su un blocco termico e batti delicatamente il tubo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione con TN5, aggiungi 300 microlitri di tampone PB e mescola facendo vibrare alla massima velocità per 25 secondi.Trasferisci l'intero volume dal tubo alla colonna di centrifugazione. Centrifuga a temperatura ambiente per un minuto alla massima velocità. Aggiungi 750 microlitri di tampone PE alla colonna di centrifugazione e centrifuga nuovamente.Quindi scarica il surnatante con il tubo di raccolta. Dopo una centrifugazione vuota, posiziona la colonna in un nuovo tubo da 1,5 millilitri etichettato. Aggiungi 10 microlitri di tampone EB a 37 gradi Celsius al centro della colonna senza toccarla.Lascialo a temperatura ambiente per un minuto. Quindi centrifuga per un minuto alla massima velocità a temperatura ambiente. Quindi ripeti i passaggi di eluizione per ottenere un volume finale di 20 microlitri in tampone EB.Esegui una PCR in tempo reale per stimare il numero di amplificazione del ciclo appropriato per l'amplificazione della libreria ATAC. Stima il numero di cicli di amplificazione finale selezionando il ciclo in cui il segnale di amplificazione raggiunge 1/3 del suo massimo per ciascun campione. Esegui l'amplificazione finale per la libreria ATAC e assegna un primer inverso diverso a ciascun campione e registralo.Amplifica ogni campione per il numero di cicli stimato per quel campione. Esegui la reazione a catena della polimerasi presentata in tubi da 200 microlitri utilizzando 10 microlitri di libreria di DNA in un volume totale di reazione di 50 microlitri. Conserva i campioni a meno 20 gradi Celsius se si interrompe il protocollo.Dopo aver purificato la libreria amplificata, esegui l'elettroforesi capillare per vedere il pattern di distribuzione della dimensione del frammento. La curva di amplificazione che risulta in una stima finale di amplificazione della libreria di meno di 15 cicli indica materiale di buona qualità adatto per la continuazione. La curva di amplificazione che mostra un aumento ritardato indica materiale di scarsa qualità e non dovrebbe essere continuata.La distribuzione della lunghezza del frammento dopo l'amplificazione ha mostrato pattern nucleosomiali a circa 150 paia di basi e 300 paia di basi nei campioni validi. Un pattern di frammenti sfumato indicava DNA sovra-tagmentato che richiedeva la ripetizione del campione. Il nostro protocollo consentirà la profilazione dell'accessibilità della cromatina su larga scala in vermi interi per comprendere come gli ambienti influenzano la regolazione genica.La sfida chiave è bilanciare l'input dei vermi e l'attività TN5 per evitare una tagmentazione insufficiente o eccessiva, garantendo una profilazione ottimale dell'accessibilità della cromatina. Questo approccio apre opportunità per studiare la variazione epigenetica attraverso isolati selvatici, condizioni ambientali e persino specie alternative.

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Analisi microarray è stato condotto per determinare profili di espressione...

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

Qui dettagliamo i protocolli specificamente progettati per monitorare i difetti morfogenici che si verificano durante le fasi precoci e tardive dell'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans. In definitiva, questi protocolli sono progettati per identificare i geni che regolano queste fasi e per caratterizzare i loro requisiti differenziali lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Qui, presentiamo un quadro per correlare la restrizione dietetica di ampio spettro di espressione genica e la durata della vita. Descriviamo i protocolli per la restrizione dietetica di ampio spettro e imaging quantitativo di espressione genica in questo paradigma. Abbiamo ulteriormente delineare analisi computazionali per rivelare alla base di funzionalità di elaborazione di informazioni dei circuiti genetici coinvolti nel rilevamento di cibo.

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Presentiamo un metodo automatico per la ricostruzione tridimensionale della linea germinale Caenorhabditis elegans . Il nostro metodo determina il numero e la posizione di ogni nucleo all'interno del germline e la distribuzione di analisi germinale della proteina e la struttura del citoscheletro.

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

Qui, presentiamo un approccio combinatorio utilizzando microscopia ad alta risoluzione, strumenti computazionali, e l'etichettatura a cella singola in vivente embrioni C. elegans per comprendere le singole dinamiche delle cellule durante il neurosviluppo.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.

Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Il presente protocollo descrive una procedura per isolare manualmente l'intestino dai vermi nematodi adulti Caenorhabditis elegans per l'input in genomica, proteomica, microbioma o altri test.

Dissezione manuale di Caenorhabditis elegans Intestini

Questo protocollo descrive un test di interferenza dell'RNA e ChIP per studiare l'ereditarietà epigenetica del silenziamento indotto dall'RNAi e le modificazioni della cromatina associate in C. elegans.

Analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

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