Un protocollo per il prelievo della sospensione a singola cellula dalle cornee dei topi
3 aprile 2026
Qui presentiamo un protocollo per ottenere sospensioni monocellulari di alta qualità da intere cornee di topo attraverso la digestione sequenziale con collagenasi A e tripsina. Questo metodo produce cellule singole vitali con alta integrità dell'RNA, rendendole compatibili con applicazioni a valle come il sequenziamento a RNA a singola cellula e il citometroa flusso y.
Questo protocollo introduce principalmente un metodo per ottenere cellule singole di alta qualità da cornee intatte di topo. Il nostro metodo è una singola cellula valida con alta integrità dell'RNA, rendendole compatibili con applicazioni a valle come la singola cellula su un diametro spesso, sottile e a flusso. Per cominciare, posizionare una femmina di topo C57BL6 soppressa tra le sei-otto settimane e soppressa su un tavolo sterile per la dissezione.
Dopo aver sciacquato le palpebre chiuse con PBS, si utilizzano forbici oftalmiche per effettuare un'incisione lungo il polo posteriore del bulbo oculare e posizionare con cura l'occhio isolato in una piastra di Petri contenente un mezzo epiteliale ormonale supplementare gelido. Dopo aver risciacquato il bulbo oculare tre volte con 1XPBS integrato con streptomicina al 5% di penicillina, si utilizzano forbici e pinze oftalmiche per effettuare un'incisione dal polo posteriore verso il limbo corneale. Distacca delicatamente la cornea dalla sclera e dalla congiuntiva lungo il bordo limbare, poi, usando due paia di pinze, rimuovi completamente lente e iride.
Dopo aver lavato il tessuto corneale tre volte in PBS, trasferire il tessuto pulito in un nuovo tubo. Aggiungi un millilitro di cinque milligrammi per ogni millilitro di soluzione di collagenasi A e trita il tessuto in frammenti di circa 0,5 per 0,5 millimetri usando forbici oftalmiche. Incubare il tubo contenente i frammenti corneali con la soluzione di collagenasi A in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per un'ora.
Ispeziona il tessuto ogni 10 minuti durante la digestione. Quando non restano frammenti di tessuto grandi, centrifuga il campione a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente, poi aspira con cura il soprantantante. Successivamente, risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione EDTA allo 0,25% di tripsina.
Inserire il tubo in un incubatore di colture cellulari impostato a 37 gradi Celsius per 10 minuti per digerire i frammenti di tessuto rimanenti. Infine, utilizza una pipetta P1000 dotata di punta a diametro largo per triturare delicatamente la miscela e ottenere una sospensione a singola cella. Centrifuga la sospensione cellulare come dimostrato in precedenza e risospensa il pellet cellulare in PBS contenente lo 0,04% di BSA.
Contando le cellule corneali isolate con un emocitometro, si è riscontrato che un totale di 1,05 volte 10 alla potenza di cinque cellule è stato ottenuto da otto cornee con una vitalità cellulare media del 94,6% e un rapporto cellulare superiore al 96,3%, confermando l'idoneità della sospensione per applicazioni a valle. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato che la sospensione cellulare comprendeva l'83,5% di cellule epiteliali pan-CK positive, il 13,5% di cellule stromali positive alla cheratocana e circa il 3% di cellule negative per entrambi i marcatori. L'RNA estratto dalla sospensione monocellulare ha mostrato un alto numero di integrità dell'RNA di circa 8,8 e un rapporto ribosomico di 28S per 18S di circa 2,15, confermando un'eccellente qualità dell'RNA.
Dopo aver ottenuto singole cellule, possiamo caratterizzare la funzione delle cellule corneali e l'esplorazione del segno superficiale. Questa zona è lo studio delle interazioni cellula-cellula. Una sfida in questo metodo è praticamente separare la cornea dagli altri tessuti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo affidabile per l'isolamento di sospensioni cellulari singole di alta qualità da cornee intere di topo. Il metodo combina una dissezione tissutale precisa con una digestione enzimatica sequenziale, consentendo la preparazione di cellule singole vitali adatte ad applicazioni successive come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) e la citometria a flusso. Il protocollo consente di ottenere un elevato numero di cellule, un'eccellente vitalità e preserva l'integrità dell'RNA, facilitando un'analisi dettagliata dell'eterogeneità cellulare corneale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oftalmologia
- Biologia cellulare
- Analisi a singola cellula
Sfondo
- La cornea è lo strato più esterno dell'occhio, essenziale per la visione e l'omeostasi della superficie oculare.
- Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) richiede sospensioni cellulari di alta qualità a singola cellula.
- Il tessuto corneale è denso e complesso, rendendo difficile la dissociazione cellulare.
- I protocolli esistenti spesso producono una bassa vitalità cellulare o una scarsa qualità dell'RNA.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per la generazione di sospensioni di singole cellule da cornee di topo integre.
- Garantire un'elevata vitalità cellulare e integrità dell'RNA per applicazioni successive.
- Permettere l'identificazione e la quantificazione accurata dei principali tipi cellulari corneali.
Metodi Utilizzati
- Dissezione delle cornee da topi C57BL6 soppressi.
- Digestione enzimatica sequenziale mediante collagenasi A e tripsina-EDTA.
- Taglio meccanico e triturazione delicata per ottenere una sospensione monocellulare.
- Valutazione della vitalità cellulare mediante colorazione con blu di tripano e conteggio con emocitometro.
- Colorazione immunofluorescente per Pancytokeratina (cellule epiteliali) e Keratocan (cellule stromali).
- Analisi dell'integrità dell'RNA mediante bioanalizzatore.
Risultati principali
- Ottenuto circa 1,05 × 105 cellule da otto cornee.
- Elevata vitalità cellulare (94,6%) e rapporto di cellule singole (96,3%).
- Composizione cellulare: 83,5% di cellule epiteliali positive per pan-CK, 13,5% di cellule stromali positive per cheratocano, circa il 3% negative per entrambi i marcatori.
- Numero di integrità dell'RNA (RIN) di circa 8,8 e rapporto rRNA 28S/18S di circa 2,15, indicativi di eccellente qualità dell'RNA.
Conclusioni
- Il protocollo produce in modo affidabile sospensioni cellulari ad alta qualità da cornee di topo.
- Le preparazioni cellulari sono adatte per applicazioni a valle impegnative, inclusa la scRNA-seq.
- Questo metodo facilita studi dettagliati sulla funzione cellulare della cornea e sulle interazioni tra cellula e cellula.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Sospensioni cellulari singole di alta qualità ottenute da cornee di mouse sono essenziali per far progredire la ricerca oftalmica nella fase di scoperta e per consentire analisi cellulari ad alta risoluzione. Questo protocollo affronta un collo di bottiglia critico nella preparazione di cellule singole vitali e con RNA integro da tessuti oculari densi, influenzando direttamente l'affidabilità delle analisi successive a livello di singola cellula. Una preparazione cellulare solida aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e sostiene la continuità traslazionale tra le fasi di scoperta e preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dell'eterogeneità cellulare della cornea a risoluzione singola.
- Supporta la validazione funzionale delle target preservando la vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso l'identificazione accurata dei tipi cellulari.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione precoce dei target oftalmici.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sospensioni cellulari singole standardizzate con elevata vitalità per lo sviluppo di saggi.
- Garantisce riproducibilità e risultati quantitativi per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula successivo.
- Prepara materiale biologico validato per flussi di lavoro di screening scalabili.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti su popolazioni cellulari corneali distinte.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia preservando la diversità cellulare corneale nativa.
- Mantiene la qualità dell'RNA per la scoperta e la validazione di biomarcatori traslazionali.
- Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio, garantendo la continuità dei dati dalla fase di scoperta a quella preclinica.
- Riduce l'ambiguità biologica negli studi oftalmici preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, consentendo una transizione fluida dalla dissociazione del tessuto all'analisi a singola cellula e ai successivi studi funzionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante un profilo single-cell ad alta fedeltà.
- Screening: Fornisce sospensioni single-cell quantitative e riproducibili pronte per saggi e screening di composti.
- Analisi: Offre metriche robuste sulla vitalità cellulare, sulla quantificazione dei tipi cellulari e sull'integrità dell'RNA per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Preserva la diversità cellulare e la qualità dell'RNA per l'allineamento dei biomarcatori e la validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato adattabile attraverso diversi programmi di ricerca oftalmica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Fornisce preparazioni standardizzate, riproducibili e scalabili a livello di singola cellula.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e migliora l'efficienza del capitale nella ricerca e sviluppo oftalmica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di asset nella fase di scoperta, corretti per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di tessuti oculari e nelle tecniche di digestione enzimatica.
- Necessita dell'accesso a saggi di vitalità cellulare, immunofluorescenza e strumentazione per l'analisi dell'integrità dell'RNA.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Adattabile ad altri tipi di tessuti densi con un'ottimizzazione del protocollo.
- La precisione nella separazione del tessuto è fondamentale per evitare contaminazioni e garantire la purezza del campione.
