Test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza del virus dell'epatite E per misurare i titoli neutralizzanti degli anticorpi

Lo scopo principale del test di neutralizzazione basato sulla riduzione della fluorescenza è quantificare il potenziale di neutralizzazione di un candidato vaccino e degli anticorpi contro l'HEV. La natura citopatica nota dell'HEV limita il saggio PRND. Questo protocollo si concentra sull'addestramento immuno-basato sulla PRND, così da visualizzare le cellule infette e successivamente l'estrazione—Per cominciare, contare le cellule HuH-7 appena divise.

Poi, posizionare un antiletto-vetro di grado microscopico in una piastra a 12 pozzi e seminare 0,2 milioni di celle per pozzo in un millilitro di DMEM completo integrato con il 10% di FBS. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aggiungere 500 microlitri di substrati senza siero contenenti 1,8 per 10 alla potenza di quattro copie genomiche di g1-HEV purificato alle cellule seminate.

Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora. Usa 500 microlitri DPBS per lavare le celle tre volte. Aggiungi due millilitri di DMEM integrati con il 2% di FBS ai pozzi.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 72 ore. Lavare le cellule tre volte con 500 microlitri di DPBS, incubandole per cinque minuti a temperatura ambiente tra un lavaggio e l'altro. Aggiungi 500 microlitri al 4% di paraformaldeide alle cellule e incubale a temperatura ambiente per 20 minuti.

Poi, lava le cellule con DPBS come dimostrato in precedenza. Dopo il lavaggio finale, incubarli in DPBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi 250 microlitri di soluzione bloccante contenente il 5% di siero normale per capra, 0,5% albumina sierica bovina e 0,3% di Triton X100 in DPBS.

Incubare in uno shaker per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovi la soluzione bloccante e lava una volta con 500 microlitri DPBS. Poi aggiungi 250 microlitri di soluzione primaria di anticorpi con una diluizione da uno a 500.

Incubare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lava le celle con DPBS tre volte come dimostrato in precedenza. Aggiungi 100 microlitri di anticorpi secondari a diluizione uno-a-1.000 e incuba per un'ora a temperatura ambiente in una camera umificata.

Esegui il ciclo di lavaggio e incubazione come dimostrato in precedenza. Aggiungi un reagente antifade da 10 microlitri con DAPI su un vetrino di vetro. Monta il copertino con le celle rivolte verso il reagente evitando le bolle d'aria.

Sigilla il slip di copertura con lo smalto per conservarlo e la visualizzazione della microscopia confocale. Contare le cellule HuH-7 appena spaccate. Successivamente, posizionare un antibottino di vetro di grado microscopico in una piastra a 12 pozzi e seminare 0,2 milioni di celle in un DMEM completo di un millilitro per pozzo.

Il giorno successivo, prepara una diluizione seriale dieci volte di anticorpi anti-ORF2 e immunoglobulina G del coniglio in mezzi senza siero, con una concentrazione iniziale di 25 microgrammi per millilitro, e fino a una diluizione finale di 10 con una potenza di meno cinque. Il volume finale della diluizione dovrebbe essere di 100 microlitri. Poi, si aggiungono 1,8 volte 10 alla potenza di quattro copie genomiche di g1-HEV purificato a ciascuna diluizione di anticorpi.

Incubare la miscela di anticorpi a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora. Lava le celle con 500 microlitri di DPBS. Aggiungi la miscela di anticorpi al virus delle cellule.

Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora. Lava le celle con un tampone da 500 microlitri. Dopo aver aggiunto DMEM con 2% FBS, incubare per 72 ore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.

Processare le cellule per la colorazione immunofluorescente come dimostrato in precedenza. Dopo aver acquisito le immagini di fluorescenza, apri il software ImageJ. Seleziona File e apri l'immagine.

Poi, seleziona Immagine, Tipo e clicca su 8-bit per convertire l'immagine RGB in formato 8-bit. Regola la soglia selezionando Immagine e scegliendo Aggiusta, poi Soglia, impostando il livello inferiore a 40 e il livello superiore a 255. Seleziona Analizza, scegli Analizza particelle e abilita Visualizza risultati, Cancella i risultati, Riassume, Esclude sui bordi e Compone regioni di interesse.

Poi clicca su OK per ottenere il conteggio dei punti fluorescenti. Calcola la percentuale di neutralizzazione e NT50 come antilog di Log10 NT50, usando la formula fornita. Traccia il grafico che mostra la media e la deviazione standard di tutti i campi.

Un livello significativo di acido ribonucleico g1-HEV è stato rilevato nelle cellule infette rispetto a quelle simulatamente infette. Il test di immunofluorescenza con anticorpi anti-ORF2 ha confermato l'espressione di ORF2 nelle cellule HuH-7 infette. Il titolo di neutralizzazione al 50% dell'anticorpo anti-ORF2 è stato stimato in 2,1 per 10 alla potenza di tre.

Immagini rappresentative mostrano la comparsa di cellule HuH-7 infette simulatamente e infettate con g1-HEV nel test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare il potenziale di neutralizzazione degli anticorpi anti-HEV e di misurare il loro titolo di neutralizzazione al 50%. Il passo cruciale di questo protocollo è l'isolamento del virus dell'epatite E infettiva e la corretta colorazione cellulare e l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione.

Metodi alternativi come RT-qPCR ed ELISA possono essere utilizzati per determinare il titolo di neutralizzazione, ma presentano alcune limitazioni.