Name: Elettrofisiologia a Singolo Canale mediante un Sistema Miniaturizzato di Bilayer Lipidico Planare di Montal–Mueller per la Registrazione di un Canale K2P Sintetico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri l'elettrofisiologia a singolo canale con il sistema miniaturizzato BLMchipMM per bilayer lipidico planare. Questa piattaforma riduce i reagenti e semplifica l'analisi funzionale dei canali ionici come ancTREK1.

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Ringraziamo Sofia Diletta Guzzeloni per l'aiuto fornito nella procedura di trasfezione cellulare. Siamo grati ai dipendenti di Elements, dottor Leon Juarez e dottor Michelangelo Paci. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Medicina Molecolare dell'Università di Pavia, Italia, nell'ambito dell'iniziativa Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), dalla Fondazione Cariplo (#2019-1809) e dal programma di ricerca PNRR CN00000013 „Centro Nazionale per l'HPC, Big Data e la Quantum Computing” assegnato a M.L.

F.T. e A.P. sono rispettivamente il CEO e un dipendente di Elements S.r.l. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

In questo studio, abbiamo utilizzato la tecnica PLB per valutare le proprietà elettrofisiologiche di un canale K2P sintetico a livello di singola molecola. Tra i vari modelli planari di lipidi descritti in letteratura scientifica, ci siamo concentrati sulla formazione di membrane lipidiche bilayer (BLM), che vengono dipinte su un'apertura dal diametro compreso tra 50 e 140 µm, praticata su una superficie verticale non polare che separa due compartimenti acquosi. Questa configurazione permette di simulare l'ambiente della membrana cellulare mantenendo il controllo sui parametri sperimentali, inclusa la preparazione della membrana lipidica e la composizione dell'elettrolita (ad esempio, forza ionica e pH)3. Abbiamo ricreato le BLM utilizzando il metodo di Montal–Mueller (a ripiegamento)5, in cui la membrana si assembla spontaneamente quando due monocati di lipidi, precedentemente depositati all'interfaccia aria–acqua delle due soluzioni acquose, si uniscono sull'apertura mediante l'aumento del livello dell'acqua.
Il protocollo qui presentato per la formazione della membrana è molto intuitivo; tuttavia, diversi passaggi critici influenzano fortemente il successo sperimentale. Per garantire un corretto collegamento elettrico tra il BLMchipMM e l'amplificatore, è essenziale evitare la clorurazione delle estremità dei fili Ag/AgCl inseriti nei connettori della PCB. Durante il montaggio del BLMchipMM, un posizionamento errato dei fili potrebbe causare il contatto con la carcassa dell'amplificatore, provocando cortocircuiti e saturazione del segnale. Un altro fattore critico è la procedura di pretrattamento dell'apertura: una forza eccessiva durante l'applicazione della soluzione di pretrattamento potrebbe danneggiare il setto in poliimide, mentre un'errata manipolazione della soluzione elettrolitica—in particolare l'immersione della zona dell'apertura—può compromettere la formazione della membrana. Inoltre, una pulizia accurata della camera di registrazione del BLMchipMM è fondamentale per la riproducibilità. L'uso di alcol isopropilico al 100%, seguito da un accurato risciacquo e un'essiccazione completa, assicura che residui non interferiscano con esperimenti successivi.
Sono possibili diverse modifiche al protocollo. Mentre la clorurazione mediante immersione in candeggina rappresenta un approccio pratico e ampiamente utilizzato, possono essere impiegati anche metodi alternativi come l'elettrodeposizione43. Analogamente, sono possibili variazioni nella pre-trattamento e nella preparazione dei lipidi. Le soluzioni standard per il pre-trattamento consistono tipicamente in alcani a catena lunga sciolti in solventi idrocarburici volatili36; sebbene sia comunemente usata una soluzione al 1% di esadecano in n-esano, altri solventi potrebbero essere adatti. La composizione lipidica può inoltre essere adattata in base alle esigenze sperimentali. Sebbene i lipidi DPhPC offrano una stabilità ottimale della membrana, possono essere utilizzate miscele lipidiche alternative, comprese composizioni naturali o sintetiche36. Un vantaggio fondamentale dei bilayer lipidici verticali formati mediante il metodo di ripiegamento è la possibilità di generare membrane asimmetriche, in cui ciascun strato è costituito da specie lipidiche diverse5,22, una caratteristica nota per influenzare la funzione delle proteine di membrana.
La risoluzione dei problemi nella formazione della membrana generalmente prevede aggiustamenti dei livelli della fase acquosa. Se inizialmente la formazione della membrana non avviene, abbassare e alzare ripetutamente il livello del buffer in un compartimento può facilitare l'assemblaggio del doppio strato. Se questo non ha successo, l'applicazione di una bolla d'aria sull'apertura può favorire la ridistribuzione dei lipidi e la formazione della membrana. Un fallimento persistente indica solitamente problemi legati al pretrattamento o a contaminazioni, nel qual caso si raccomanda di pulire la camera di registrazione e ripetere l'esperimento.
I componenti principali di questa configurazione comprendono l'amplificatore compatto eNPR da 100 kHz e il BLMchipMM. L'amplificatore è un sistema voltage-clamp compatto e a basso rumore che elimina la necessità di dispositivi esterni aggiuntivi, inclusi gabbie di Faraday esterne, poiché la stessa carcassa dell'amplificatore fornisce una schermatura elettromagnetica efficace. Il BLMchipMM è una camera di registrazione preassemblata e miniaturizzata, integrata con una scheda PCB per il collegamento diretto all'amplificatore. È costituita da due compartimenti a forma di C separati da un setto in poliimide con un'apertura conica realizzata al laser, dove viene formata la membrana artificiale. Le dimensioni ridotte del sistema, con volumi dei compartimenti di circa 110 µL, riducono in modo significativo il consumo di reagenti e l'induttanza intrinseca, migliorando così la qualità del segnale. Inoltre, il dispositivo può essere riutilizzato più volte senza smontaggio, se vengono seguite adeguate procedure di pulizia, riducendo la variabilità e migliorando la riproducibilità sperimentale.
Nonostante questi vantaggi, alcune limitazioni devono essere prese in considerazione. L'attuale configurazione non include moduli integrati per il controllo di temperatura, pressione o perfusione. È stato riportato che la tensione intrinseca della membrana influisce sui canali meccanosensibili come TREK144,45,46; tuttavia, la configurazione attuale non prevede una manipolazione controllata della tensione della membrana, e in questo contesto non vengono tratte conclusioni meccanicistiche. Nel complesso, questa piattaforma fornisce un sistema solido e accessibile per la registrazione dell'attività dei canali ionici in membrane artificiali. In questo studio, abbiamo analizzato il canale sintetico K2P ancTREK1, un canale ancestrale derivato computazionalmente dalla sottofamiglia TREK. I dati registrati dimostrano che ancTREK1 purificato, recostituito in PLB, mostra un comportamento a singolo canale coerente con le proprietà di conduttanza tipiche di TREK1. In condizioni simmetriche di potassio 200 mM senza Mg2+, il canale mostra una relazione I–V misurabile, con valori di ampiezza di circa 13 pA a 80 mV e −19 pA a −80 mV. Inoltre, ancTREK1 presenta la modalità di conduttanza caratteristicamente elevata osservata nei canali TREK1, con una conduttanza maggiore a potenziali negativi (~205,6 pS) rispetto a potenziali positivi (~112,8 pS). In particolare, ancTREK1 mostra un NPo aumentato a potenziali positivi (0,78 a 80 mV) e un NPo ridotto a potenziali negativi (0,53 a −80 mV e 0,28 a −120 mV), in contrasto con quanto osservato in configurazioni con patch escissi42. Questi risultati supportano l'utilizzo di questo sistema per la registrazione, a livello di principio dimostrativo, dell'attività a singolo canale di proteine di membrana reconstituite.

La ricostruzione di canali ionici in membrane bilitiche artificiali, nota anche come membrane lipidiche nere (BLM), è una delle tecniche consolidate per effettuare la caratterizzazione elettrofisiologica dei canali ionici a livello di singola molecola1. I vantaggi delle BLM derivano dalla loro struttura. Infatti, un bistrato lipidico planare (PLB) viene creato all'interno di un poro su una superficie non polare, separando due soluzioni liquide. In questo modo, imitando una membrana biologica, consente la registrazione dell'attività dei canali ionici in condizioni altamente controllate, inclusa la composizione lipidica della membrana e le concentrazioni di elettroliti o composti chimici, pur rimanendo accessibile da entrambi i lati. Questa accessibilità permette inoltre l'inserimento diretto dei canali ionici, ad esempio da una soluzione micellare o mediante fusione mediata da liposomi2,3.
Il primo sistema di membrana artificiale descritto fu creato mediante la tecnica della pittura4, in cui una goccia di lipidi disciolti in un solvente organico non volatile viene applicata su una piccola apertura con un pennello. L'aggiunta di una soluzione acquosa su entrambi i lati dell'apertura porta quindi alla formazione spontanea di un doppio strato lipidico. Tuttavia, uno svantaggio significativo di questo metodo è la ritenzione di tracce di solvente, che potrebbe alterare le proprietà della membrana. Per ridurre la quantità di solvente organico residuo nei doppi strati lipidici, fu sviluppato il metodo della piegatura5, che permette la formazione di membrane lipidiche bilaminari (BLM) «prive di solvente». In questo approccio, una soluzione lipidica in un solvente volatile viene stesa sulla superficie dell'acqua per formare due monocouche, e aumentando gradualmente il livello della fase acquosa al di sopra dell'apertura, queste monocouche lipidiche si piegano sull'apertura formando un doppio strato. Tuttavia, sebbene la BLM risultante sia definita priva di solvente, la formazione efficace del doppio strato richiede un pretrattamento dell'apertura con uno strato sottile di solvente non volatile. L'elemento fondamentale necessario per questi esperimenti consiste in una camera di registrazione con due compartimenti acquosi (generalmente indicati come cis e trans) separati da un setto lipofilico con una piccola apertura (di diametro compreso tra 50 e 250 µm) (Figura 1). Elettrodi in argento/argento clorurato (Ag/AgCl) vengono inseriti in ciascun compartimento. Quando immersi nella soluzione elettrolitica, questi elettrodi stabiliscono il collegamento elettrochimico tra la membrana lipidica e l'apparato di registrazione. Quest'ultimo comprende un amplificatore a clamp di tensione, che consente un controllo preciso del potenziale transmembrana e la misurazione simultanea delle correnti ioniche che attraversano le proteine formanti pori incorporate nella membrana.
<img alt="Diagramma del canale ionico in bicella lipidica; configurazione di elettrofisiologia; analisi degli stati chiuso/aperto del canale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Schema della configurazione sperimentale per l'elettrofisiologia in bicella lipidica planare (PLB). Rappresentazione schematica dei componenti essenziali necessari per esperimenti con bicella lipidica planare (PLB). La camera di registrazione è composta da due compartimenti acquosi (cis e trans) separati da un setto lipofilico contenente un'apertura in cui viene formata una bicella lipidica. Degli elettrodi al cloruro d'argento (Ag/AgCl) sono immersi nella soluzione elettrolitica di ciascun compartimento. Uno degli elettrodi applica stimoli di tensione (ad esempio, forme d'onda sinusoidali, quadre o triangolari), mentre l'altro, collegato a massa, è connesso a un convertitore di corrente in tensione che trasforma la corrente ionica in un segnale di tensione proporzionale. Il segnale viene amplificato, opzionalmente filtrato, digitalizzato e registrato per il monitoraggio e l'analisi in tempo reale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Sono stati sviluppati anche altri metodi per formare BLM. Tra questi, un approccio comune consiste nella creazione di bicatene lipidiche sospese sulla punta di una pipetta per patch-clamp. Di conseguenza, il metodo detto "tip-dip"6 permette la formazione di una bicatena lipidica libera da solvente sospesa sull'apertura di una micropipetta di vetro con un diametro di circa 4 µm, immergendo ripetutamente la punta attraverso un monostrato lipidico all'interfaccia aria-acqua, catturando così un singolo strato durante ogni passaggio. La tecnica del patch-clamp è stata utilizzata anche per misurazioni a canale singolo in bicatene lipidiche. Ad esempio, nel metodo "punch-out"7, una pipetta di vetro con un diametro compreso tra 10 e 80 µm viene usata per sigillare una membrana di grandi dimensioni precedentemente formata su un'apertura in una camera di registrazione. In alternativa, il metodo liposoma-patch prevede l'uso di una vescicola preformata di dimensioni nano- a micrometriche come BLM priva di solvente8,9. In particolare, le vescicole unilamellari giganti sono state ampiamente utilizzate per registrazioni a canale singolo mediante diverse configurazioni del patch-clamp, incluse le modalità "cell-attached" ed "excised patch"10,11.
Sono inoltre emerse diverse piattaforme per la formazione parallela e automatizzata di più bicapidi. Uno di questi approcci è la tecnica del bicapido da interfaccia tra gocce (droplet interface bilayer, DIB)12, in cui gocce acquose vengono posizionate in una miscela di lipidi e solvente. In questo metodo, i monocapidi lipidici si assemblano spontaneamente attorno alle gocce e la formazione del bicapido avviene quando due gocce entrano in contatto. In alcuni allestimenti, i DIB possono essere formati su idrogeli per migliorare la stabilità della membrana13. Un approccio alternativo basato sulla formazione di DIB all'estremità di una pipetta di vetro è il metodo del bicapido da bolla di contatto (contact bubble bilayer, CBB)14, in cui bolle acquose vengono introdotte in una fase oleosa mediante due micropipette. Come nell'approccio DIB, un bicapido lipidico si forma spontaneamente quando due bolle rivestite di lipidi vengono portate a contatto. Un'altra piattaforma è rappresentata dai sistemi di BLM in array, costituiti da schiere di pori ben definiti su scala micro- a nanometrica disposti in una configurazione a griglia. In questi sistemi, i bicapidi lipidici sospesi possono essere formati manualmente — mediante tecniche di pennellatura o ripiegamento, oppure tramite rottura di vescicole liposomiali15,16,17 — oppure automaticamente mediante iniezione sequenziale di soluzioni lipidiche e tampone, quando abbinati a strutture di canali microfluidici18,19.
Sebbene siano stati sviluppati numerosi metodi per formare BLM senza solvente, in questo lavoro ci concentriamo sul metodo del ripiegamento implementato all'interno di una piattaforma miniaturizzata e integrata per studiare il comportamento di canali singoli di proteine di membrana incorporate in un bilayer lipidico artificiale. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando il sistema Elements, composto da due componenti: l'amplificatore Nanoporo Elements (eNPR) e il BLMchipMM (Figura 2A e Figura 2B). Il primo è un amplificatore compatto a basso rumore per voltage-clamp che semplifica l'area di lavoro costituendo un'unità completa e indipendente, eliminando la necessità di dispositivi esterni aggiuntivi. Il BLMchipMM è un sistema preassemblato e miniaturizzato progettato per la tecnica Montal–Mueller e funge da interfaccia sperimentale. È costituito da una camera di registrazione in polimetilmetacrilato (PMMA) trasparente integrata con una scheda a circuito stampato (PCB), che include due alloggiamenti progettati per contenere fili Ag/AgCl utilizzati come elettrodi per il collegamento diretto all'amplificatore. La struttura principale della camera è un setto in poliimide sigillato tra due componenti in PMMA trasparenti. Il setto ha uno spessore di 50 µm, tranne in una piccola regione centrale (3,78 mm2), dove lo spessore è ridotto a 25 µm per facilitare la formazione del bilayer. Al centro di questa regione più sottile, un'apertura conica viene realizzata mediante foratura laser, il che migliora la stabilità meccanica del bilayer lipidico20,21. Sono disponibili quattro diametri di apertura (50, 75, 100 e 140 µm), consentendo la regolazione della capacità della membrana (Tabella 1). Ogni componente in PMMA presenta una cavità a forma di C con un volume di 110 µL, formando due compartimenti fluidici su entrambi i lati del setto in poliimide per contenere la soluzione elettrolitica. In ciascun blocco in PMMA sono praticati due canali fluidici inclinati su lati opposti: un canale viene utilizzato per inserire l'elettrodo Ag/AgCl, mentre l'altro permette la regolazione manuale del livello del buffer nel serbatoio mediante pipettaggio.
<img alt="Dispositivo microfluidico con compartimento modulare; lo schema mostra il lato in PMMA, gli elettrodi, la PCB per l'analisi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Sistema integrato Elements Nanopore Reader e BLMchipMM. (A) Fotografia che mostra il BLMchipMM inserito nello slot dedicato dell'amplificatore Elements Nanopore Reader (eNPR). (B) Rappresentazione schematica dei componenti del BLMchipMM, inclusa la camera di registrazione in polimetilmetacrilato (PMMA), il setto in poliimide contenente l'apertura di dimensioni micrometriche e la scheda a circuito stampato (PCB) con alloggiamenti per elettrodi Ag/AgCl e uno slot per l'allineamento della camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diametro del foro (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spessore del foro (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capacità tipica della membrana (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Caratteristiche dei formati di apertura disponibili per BLMchipMM. Diametro del foro, spessore della settima nella regione dell'apertura e valori tipici di capacità della membrana per dispositivi BLMchipMM con aperture di 50, 75, 100 e 140 µm. I valori di capacità della membrana sono riportati per bicamere formate da lipidi 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
In genere, le camere di registrazione utilizzate nei laboratori sono dispositivi artigianali o prodotti disponibili in commercio. Nel primo caso, la costruzione del sistema richiede l'assemblaggio di diverse componenti e lo sviluppo di un metodo affidabile per creare l'apertura nel setto, il che può limitare l'accessibilità per molti laboratori. Anche quando si utilizzano dispositivi commerciali, spesso è necessaria l'integrazione manuale di più componenti prima di ogni esperimento. Al contrario, il BLMchipMM è preassemblato e non richiede smontaggio tra un esperimento e l'altro per le normali procedure di pulizia. La stessa unità può essere lavata e riutilizzata per più esperimenti senza compromettere la qualità della formazione della membrana, a condizione che i solventi impiegati siano compatibili con i materiali del dispositivo. Ciò riduce la variabilità dipendente dall'operatore e minimizza il rischio di perdite associate agli elementi di sigillatura manuali. L'uso di elettrodi esterni in filo d'argento, sostituibili e rigenerabili, aumenta ulteriormente la durata utile del sistema, in particolare in condizioni sperimentali che accelerano il consumo degli elettrodi.
Inoltre, i dispositivi artigianali spesso presentano volumi delle camere elevati, aumentando la quantità di componenti biologici e chimici necessari per gli esperimenti. Al contrario, la miniaturizzazione del BLMchipMM permette di ridurre al minimo i volumi sperimentali, riducendo così in modo significativo il consumo di reagenti, proteine e altri composti. Questo è particolarmente vantaggioso quando si lavora con proteine di membrana difficili da esprimere o con rese basse, oppure quando l'elevato costo della sintesi dei composti da testare aumenta il costo complessivo degli esperimenti. È importante notare che il BLMchipMM consente la formazione di bicelle con quantità minima di solvente e supporta configurazioni asimmetriche della membrana, in cui ciascun strato può essere composto da specie lipidiche diverse5,22, facilitando lo studio della funzione delle proteine di membrana in condizioni controllate.
Tradizionalmente, le misurazioni della corrente vengono effettuate utilizzando amplificatori progettati per esperimenti di patch-clamp, che spesso richiedono il collegamento a un digitizzatore separato per l'acquisizione dei dati e il controllo tramite interfacce grafiche. Questi sistemi non sono solo ingombranti ed economicamente costosi, ma spesso comportano procedure di configurazione poco intuitive per utenti non esperti. Inoltre, a causa delle dimensioni della camera di registrazione e della progettazione degli amplificatori standard—che tipicamente non dispongono di schermatura integrata per proteggere l'ingresso dello stadio di testa da interferenze elettrostatiche—è spesso necessario l'uso di una gabbia di Faraday esterna. La qualità e il collegamento a terra di tale gabbia possono influenzare in modo significativo le prestazioni del sistema in termini di rumore. Il BLMchipMM, utilizzato insieme a un amplificatore integrato compatto, semplifica questa configurazione riducendo la necessità di componenti esterni. La digitalizzazione del segnale avviene all'interno del dispositivo e l'involucro del sistema fornisce una schermatura che riduce la suscettibilità alle interferenze elettromagnetiche ambientali.
Per dimostrare l'applicabilità di questa piattaforma, il canale di tipo K2P ancTREK1, un membro ancestrale della sottofamiglia TREK derivato mediante analisi computazionale (Supplementary Figure 1), è stato utilizzato come proteina modello per validare il corretto ripristino della funzionalità e la registrazione di canali singoli. I canali K2P formano canali di perdita di potassio dimetrici che regolano il potenziale di membrana a riposo e l'eccitabilità cellulare, con i canali TREK che rappresentano una sottofamiglia ben caratterizzata.

<table><tbody><tr><td>1,2-difitanoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Formazione di bicelle lipidiche artificiali</td></tr><tr><td>2-propanolo (&amp;ge;99,5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Pulizia del dispositivo BLMchipMM</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Preparazione di gel di agarosio</td></tr><tr><td>Sistema orizzontale per elettroforesi su gel di agarosio</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Separazione di frammenti di DNA</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Selezione di batteri trasformati</td></tr><tr><td>Resina di Sepharose con nanocorpo anti-GFP (autoprodotto)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Purificazione per affinità di proteine marcate con GFP</td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina Anza</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Deposforilazione del vettore</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Digestione con enzimi di restrizione</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Digestione con enzimi di restrizione</td></tr><tr><td>Buffer Rosso Anza (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Buffer per digestione con enzimi di restrizione</td></tr><tr><td>Inibitore delle proteasi aprotinina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Prevenzione della degradazione proteica</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Formazione del pellet cellulare e preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Formazione di bicelle lipidiche piane</td></tr><tr><td>Emisuccinato di colesterolo (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Stabilizzazione delle proteine di membrana</td></tr><tr><td>Blu Coomassie Brillante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Colorazione delle proteine</td></tr><tr><td>Disinfettante comune a base di ipoclorito</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Clorurazione dei fili di Ag</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Riduzione della viscosità del lisato</td></tr><tr><td>Acqua bidistillata</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparazione di tamponi e soluzioni</td></tr><tr><td>Etilene (puro, 99,9%)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Pulizia dei fili Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>Colorazione del DNA</td></tr><tr><td>Carta vetrata a grana finissima</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Rimozione del rivestimento Ag/AgCl dai fili</td></tr><tr><td>Amplificatore eNPR 100 kHz</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Registrazioni elettrofisiologiche</td></tr><tr><td>Kit Gel-Out per estrazione del DNA da agarosio</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>Purificazione del DNA</td></tr><tr><td>Scala molecolare di DNA GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>Riferimento per la dimensione del DNA</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Espressione della proteina ancTREK1</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Agente tampone</td></tr><tr><td>Esadecano (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Pretattamento dell'apertura</td></tr><tr><td>Esaano (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Solvente lipidico</td></tr><tr><td>Colorante per caricamento del DNA autoprodotto 5&amp;times;</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparazione del campione di DNA</td></tr><tr><td>Buffer Laemmli SDS autoprodotto 6&amp;times; (riducente)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparazione del campione proteico</td></tr><tr><td>Soluzione autoprodotto per decolorazione</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Decolorazione dei gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Proteasi HRV-3C autoprodotto</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Scissione delle proteine di fusione</td></tr><tr><td>Buffer di corsa SDS-PAGE autoprodotto (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Buffer per elettroforesi SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Eluizione di proteine con tag His</td></tr><tr><td>Colonne per purificazione in batch</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Flussi di lavoro per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Incubatore agitatore Innova44</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Crescita delle colture cellulari</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Preparazione di elettroliti e tamponi</td></tr><tr><td>Brodo LB (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Coltura batterica</td></tr><tr><td>Inibitore delle proteasi leupeptina</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Prevenzione della degradazione proteica</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Componente del tampone</td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>Quantificazione di DNA e proteine</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&amp;beta;-D-maltoside (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Solubilizzazione delle proteine di membrana</td></tr><tr><td>Resina Ni Sepharose High Performance</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>Purificazione IMAC</td></tr><tr><td>Notebook (computer)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Controllo degli strumenti e acquisizione dati</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Optima LE-80K</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Isolamento della frazione di membrana</td></tr><tr><td>Pentano (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Solvente lipidico</td></tr><tr><td>Inibitore delle proteasi pepstatina A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Prevenzione della degradazione proteica</td></tr><tr><td>Buffer Phusion GC (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>Buffer per PCR</td></tr><tr><td>Polimerasi del DNA Phusion ad alta fedeltà</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Amplificazione PCR</td></tr><tr><td>Inibitore delle proteasi PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Protezione delle proteine durante il lisaggio</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Reagente per trasfezione</td></tr><tr><td>Gel preformato ProteinEle Tris-Glicina (4&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Separazione delle proteine</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi su gel SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Elettroforesi delle proteine</td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Potenziatore dell'espressione proteica</td></tr><tr><td>Ligasi del DNA T4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>Ligazione del DNA</td></tr><tr><td>Buffer per ligasi del DNA T4 (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Buffer per ligazione</td></tr><tr><td>Ciclatore termico (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>Amplificazione PCR</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Preparazione di tamponi</td></tr><tr><td>Agar triptone SOYA con lecitina e polisorbato 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Piastre per batteri</td></tr><tr><td>Due fili di Ag</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elettrodi per elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Concentratore ultraveloce (cutoff 50 kDa)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Concentrazione delle proteine</td></tr><tr><td>Vettore di espressione pEG BacMam</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Espressione proteica</td></tr><tr><td>Cavo USB</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Collegamento tra amplificatore e computer</td></tr></tbody></table>

elettrofisiologia a singolo canale mediante un sistema miniaturizzato di bilayer lipidico planare di montal–mueller per la registrazione di un canale k2p sintetico

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

La riconstituzione funzionale di canali ionici in bistrati lipidici piani fornisce una strategia per indagare l'attività del canale a livello di singola molecola. Tuttavia, i tradizionali sistemi di bistrato di Montal–Mueller richiedono tipicamente apparati sperimentali ingombranti, assemblaggio manuale della camera e volumi di registrazione relativamente elevati, il che aumenta il consumo di reagenti e può introdurre ulteriori fonti di rumore elettrico a causa di cablaggi prolungati e testine esterne. In questo studio, presentiamo una piattaforma miniaturizzata e pronta all'uso (BLMchipMM) integrata con un amplificatore compatto che consente registrazioni stabili a livello di singolo canale con ridotto consumo di reagenti e operatività semplificata. Questo protocollo descrive l'utilizzo di questo sistema per effettuare misurazioni di elettrofisiologia a singolo canale. Utilizzando questo sistema, abbiamo riconstituito un canale K2P sintetico (ancTREK1) e lo abbiamo impiegato come proteina modello per validare la riconstituzione e la registrazione a singolo canale. Le registrazioni a singolo canale mostrano una relazione corrente–tensione in soluzioni simmetriche di K+ prive di Mg2+, con valori di conduttanza coerenti con quelli riportati per i canali TREK1. La riconstituzione riuscita di questo canale simile a K2P dimostra l'utilità di questo sistema per l'analisi a singolo canale in membrane artificiali.

Caratteristiche corrente–tensione (I–V) delle membrane PLB
La natura idrofobica intrinseca delle membrane a doppio strato le rende impermeabili alle specie cariche. Tuttavia, l'applicazione di un campo elettrico esterno può indurre la formazione di pori transitori di dimensioni nanometriche, alterando così la permeabilità e la conduttanza della membrana33. Per valutare la qualità dei doppio strato artificiali formati da lipidi 1,2-difitanoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina, sono state analizzate la capacità, la resistenza e le caratteristiche corrente–tensione della membrana in assenza di proteine inserite. È stata applicata una serie di gradini di tensione compresi tra ±20 e ±200 mV (con incrementi di ±20 mV) e sono state registrate le correnti transmembranee risultanti. I dati sono stati campionati a 5 kHz e filtrati passa-basso a 2,5 kHz.
La capacità della membrana (Cm) e la resistenza della membrana (Rm) rappresentano parametri fondamentali per valutare la qualità del bilayer. Il PLB può essere descritto da un circuito equivalente resistore-condensatore (RC), in cui la membrana si comporta come un condensatore in parallelo con un resistore34. La componente capacitiva riflette la capacità della membrana di accumulare carica, mentre la componente resistiva riflette la permeabilità agli ioni. L'applicazione di un'onda di tensione triangolare genera una risposta di corrente capacitiva di forma quadrata, proporzionale alla capacità della membrana secondo la seguente relazione:
<img alt="Formula della corrente capacitiva I_c=C_m(dv/dt), che illustra l'analisi dei circuiti elettrici." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equation 1">    (1)
Qui, Cm è la capacità della membrana, V è la tensione applicata e t è il tempo. Dopo la formazione della membrana, i valori di capacità possono aumentare nel tempo a causa dell'assottigliamento progressivo del doppio strato35. Considerando la membrana come un condensatore a piastre piane parallele, la capacità è correlata all'area e allo spessore della membrana secondo la seguente relazione:
<img alt="Formula della capacità con lipidi, equazione, diagramma educativo, costante dielettrica." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equazione 2">    (2)
Qui, εlipids è la costante dielettrica del nucleo lipidico (~2), ε0 è la permittività dello spazio libero, A è l'area della membrana e d è lo spessore della membrana36,37.
La resistenza della membrana è stata determinata utilizzando la legge di Ohm33:
<img alt="Equazione della forza elettromotrice Ir=V/Rm, diagramma didattico sulla resistenza elettrica." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equazione 3">    (3)
In questo caso, V è la tensione applicata e Rm è la resistenza della membrana. In assenza di canali ionici, la corrente di membrana rimane vicina a 0 pA, corrispondente a valori di resistenza nell'ordine dei gigaohm (GΩ)33.
La relazione I–V ha mostrato un comportamento lineare (ohmico) tra 0 e ±200 mV per i dispositivi BLMchipMM con aperture di 75 e 100 µm. L'adattamento lineare dei dati ha fornito valori di resistenza della membrana di 847 ± 16 GΩ (n = 6) per l'apertura di 75 µm (Figura 8A, cerchi) e di 980 ± 32 GΩ (n = 7) per l'apertura di 100 µm (Figura 8A, quadrati). I valori di rumore RMS, misurati su segmenti di 3 s della traccia di corrente, sono stati di 3,1 ± 2 pA (n = 7) per l'apertura di 100 µm e di 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) per l'apertura di 75 µm. La stabilità della membrana è stata valutata misurando la resistenza a intervalli di circa 2 min per una durata totale di 1 h (Figura 8B). Membrane ben formate sono rimaste costantemente stabili per oltre 1 h, tempo sufficiente per la maggior parte degli esperimenti elettrofisiologici. Le membrane hanno generalmente tollerato potenziali applicati fino a ±200 mV senza segni di instabilità, mentre il collasso si è verificato tra ±220 e ±300 mV a seconda del singolo bistrato. Le membrane sono state considerate adatte all'inserimento di proteine quando i valori di capacità erano compresi tra 40 e 60 pF per aperture di 75 µm e tra 60 e 90 pF per aperture di 100 µm, con valori di corrente ≤0,5 pA a 100 mV.
<img alt="Grafici tensione-corrente e resistenza-tempo, studio del chip con membrana bilivello, risultati dell'analisi dati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8: Caratterizzazione elettrica dei PLB. (A) Relazioni corrente–tensione (I–V) di bilayer formati su aperture da 75 µm e 100 µm, che mostrano un comportamento lineare (ohmico) nell'intervallo compreso tra ±200 mV. La regressione lineare fornisce valori di resistenza della membrana pari a 847 ± 16 GΩ (n = 6) e 980 ± 32 GΩ (n = 7), rispettivamente. (B) Stabilità della membrana valutata monitorando la resistenza per 1 h a intervalli di 2 min. Le membrane rimangono stabili fino a ±200 mV e si rompono a tensioni comprese tra ±220 e ±300 mV. I dati sono riportati come media ± errore standard della media (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Caratterizzazione iniziale del comportamento del canale singolo di ancTREK1
L'ancTREK1 sintetico è stato purificato e reintrodotto in vescicole lipidiche planari (PLB), e l'attività a canale singolo è stata monitorata utilizzando protocolli a gradino di tensione compresi tra −120 e 120 mV con incrementi di 20 mV. Le registrazioni a canale singolo (Figura 9A e Figura 9B) hanno rivelato il comportamento caratteristico di apertura e chiusura rapida (flickering) dei canali K2P38. A 80 mV, l'ampiezza media della corrente era di 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), mentre a −80 mV l'ampiezza della corrente è aumentata a −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Figura 9C). La relazione corrente–tensione (I–V) risultante ha mostrato correnti misurabili a livello di canale singolo sia a potenziali positivi che negativi in condizioni simmetriche di potassio 200 mM in assenza di Mg2+ (Figura 9D). Poiché le ampiezze delle correnti sono state stimate da istogrammi di tutti i punti delle registrazioni acquisite a 5 kHz e filtrate passa-basso a 2,5 kHz, questa relazione I–V è presentata come prova descrittiva del principio di funzionamento piuttosto che come una caratterizzazione biofisica esaustiva.
<img alt="Analisi dell'attività dei canali ionici; grafico delle tracce di corrente e degli istogrammi di ampiezza a +80 mV, -80 mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9: Attività di singolo canale di ancTREK1 sintetico. (A e B) Tracce rappresentative della corrente di singolo canale registrate rispettivamente a 80 mV e −80 mV. Le linee tratteggiate indicano il livello di chiusura del canale. (C) Istogrammi di ampiezza di tutti i punti per potenziali positivi (sinistra) e negativi (destra). (D) Relazione corrente-tensione (I–V) di ancTREK1 in condizioni simmetriche di 200 mM di potassio (K+) in assenza di cationi bivalenti. La curva è stata adattata utilizzando un polinomio di quarto ordine e i valori di conduttanza sono stati ricavati dalla pendenza a ±80 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Sebbene ancTREK1 manchi di regioni N- e C-terminali allungate rispetto ai canali TREK1 dei mammiferi, è rimasto funzionalmente attivo dopo la reconstituzione. A differenza del TREK1 dei mammiferi, che mostra modalità di conduttanza alta e bassa (132 ± 5 pS e 41 ± 5 pS a potenziali positivi, rispettivamente)39, ancTREK1 ha mostrato soltanto la modalità ad alta conduttanza. La conduttanza del singolo canale a potenziali positivi era di 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), coerente con i valori riportati per i canali TREK (85–130 pS in condizioni simmetriche di potassio)38,39,40,41. A potenziali negativi, la conduttanza è aumentata a 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), in accordo con il comportamento precedentemente descritto per TREK139. In particolare, ancTREK1 ha mostrato una probabilità di apertura normalizzata (NPo) più elevata rispetto alle misurazioni di TREK1 ottenute mediante configurazioni di patch excised42. La relazione NPo–tensione ha mostrato un aumento dell'attività del canale a potenziali positivi, raggiungendo 0,78 ± 0,02 (n = 5) a 80 mV. Al contrario, l'NPo è diminuito a potenziali negativi, con valori di 0,53 ± 0,04 a −80 mV e di 0,28 ± 0,03 a −120 mV (Figura 10).
<img alt="Risultati di elettrofisiologia dei canali ionici, grafico di NPo rispetto al voltaggio (mV), confronto con istogramma, analisi dei dati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 10"> 
Figura 10: Analisi della dipendenza dal voltaggio dell'attività monocanale di ancTREK1. Probabilità di apertura normalizzata (NPo) in funzione del potenziale di membrana (a sinistra) e confronto della NPo a 80 mV e −80 mV (a destra), che mostra un aumento dell'apertura del canale a potenziali positivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare 1. Sequenza amminoacidica del canale del potassio (K2P) sintetico ancestrale a due pori (ancTREK1). La sequenza amminoacidica completa di ancTREK1 utilizzata per le registrazioni elettrofisiologiche. La sequenza è stata ricostruita mediante inferenza della sequenza ancestrale a partire da un insieme di dati curato di membri della famiglia TREK/TRAAK, inclusi sequenze ortologhe raccolte dai database UniProt e NCBI, filtrate per motivi conservati del poro, allineate e analizzate mediante filogenetica a massima verosimiglianza.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive l'uso di un sistema miniaturizzato di bilayer lipidico planare di Montal–Mueller con amplificazione integrata per effettuare registrazioni stabili di canali singoli. Il metodo viene dimostrato ricostituendo un canale K2P sintetico purificato per convalidare le prestazioni del sistema.

Elettrofisiologia a Singolo Canale mediante un Sistema Miniaturizzato di Bilayer Lipidico Planare di Montal–Mueller per la Registrazione di un Canale K2P Sintetico

La ricostituzione funzionale di canali ionici in doppi strati lipidici planari fornisce una strategia per indagare l'attività dei canali a livello di singola molecola. ...

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione del funzionamento dei canali ionici e dei trasportatori, utilizzando tecniche integrate di biologia strutturale ed elettrofisiologiche. I tradizionali allestimenti con bilayer richiedono strumentazione complessa e assemblaggio manuale, mentre questa piattaforma è miniaturizzata, pronta all'uso e integra un amplificatore compatto.Per iniziare, preparare l'apparato di elettrofisiologia eseguendo la calibrazione dello strumento e preparando gli elettrodi in argento o cloruro di argento. Inserire le estremità non clorurate dei due fili d'argento nei connettori della scheda a circuito stampato o PCB. Posizionare le estremità clorurate dei fili all'interno dei canali fluidici ricavati nel componente in polimetilmetacrilato o PMMA. Ruotare delicatamente il chip della membrana lipidica nera o BLMchipMM e montarlo sulla PCB inserendo il dente inferiore della camera di registrazione in PMMA nella fessura apposita. Assicurarsi che il filo raggiunga l'estremità dei canali fluidici. Preparare 100 microlitri di una soluzione al 1% volume su volume di esadecano in n-esano al 100% per il trattamento preventivo dell'apertura del setto. Ri-sospendere

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