Imaging a risonanza magnetica multianimale per misurazioni tumorali in modelli topini di cancro al pancreas

L'adenocarcinoma del pancreas dottale è una malattia altamente letale. Il PDAC viene solitamente diagnosticato in stadi avanzati con malattia localmente avanzata o metastatica, rendendola ancora più difficile da trattare. Il PDAC è una malattia eterogenea caratterizzata da cellule tumorali altamente aggressive, reazioni desmoplastiche estese e ipovascolarità.

I modelli murini geneticamente ingegnerizzati e guidati da KRAS sono particolarmente adatti alla valutazione terapeutica preclinica, poiché portano con sé una mutazione simile a quella delle cellule pancreatiche umane e sviluppano spontaneamente tumori pancreatici con patologia fisiologica e caratteristiche molecolari simili a quelle del PDAC umano. Il modello KPC eliminato con P53 guidato da KRAS è un modello di topo geneticamente ingegnerizzato con PDAC ben caratterizzato. Per monitorare efficacemente lo sviluppo tumorale e valutare le risposte terapeutiche nel modello KPC, le modalità avanzate di imaging in vivo, come l'imaging a risonanza magnetica, sono strumenti di ricerca essenziali.

La risonanza magnetica è ampiamente considerata la modalità di imaging standard d'oro per la valutazione dei tumori profondi, mostrando il più alto grado di contrasto anatomico dei tessuti molli e sensibilità molecolare per i bersagli dei tessuti profondi. Tuttavia, i protocolli standard della risonanza magnetica comportano elevati costi operativi e lunghi tempi di accusa. Questo protocollo utilizza una camera multi-animale per l'imaging parallelo a risonanza magnetica di fino a quattro topi per la rilevazione dei tumori adenocarcinomatici pancreatici, come metodo rapido, economico e preciso per la rilevazione e la misurazione del tumore per studi preclinici, reclutamento animale e monitoraggio della risposta al trattamento.

In breve, iniziamo preparando l'animale per la procedura e allestendo il letto per la risonanza magnetica multi-animali con i nostri inserti stampati in 3D. Successivamente procediamo con la risonanza magnetica, seguita dall'analisi dei dati per determinare il successo del trattamento per gli studi preclinici. Trasportare topi sperimentali KPC dalla struttura animale alla struttura di imaging.

Anestesiate fino a quattro topi in una camera di induzione piuttosto calda e sigillata con isoflurano. Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi di ogni topo per prevenire la disidratazione corneale. Posizionare due topi anestetizzati in posizione ventrale sulla parte inferiore dell'inserto del letto stampato in 3D, che è fissato al supporto standard per la risonanza magnetica PET per ratti singoli fornito dal fornitore.

Fissa la testa e un cono nasale per mantenere l'anestesia. Durante la scansione dei topi trattati, si applica una barriera protettiva per prevenire il potenziale trasferimento di agenti chemioterapici tramite escrezioni. Copri il fondo con la parte superiore degli inserti del letto stampati in 3D.

Posiziona altri due topi anestetizzati in posizione ventrale sulla parte superiore dell'inserto del letto stampato in 3D. Fissa la testa in un cono nasale per mantenere l'anestesia. Il letto PET MRI singolo fornito dal fornitore è dotato di aria calda circolante per mantenere la temperatura corporea degli animali.

Collega il monitor respiratorio al mouse posizionato sul lato sinistro dell'inserto 3D superiore del letto. Copri il letto per completare la camera della risonanza magnetica multi-animali. Assicurati che i topi siano posizionati al centro della bobina della risonanza magnetica allineando il laser rosso con il centro dei topi.

Assegna un'etichetta alla scansione usando l'ID del mouse e la data della scansione nel formato seguente. Stiramento, identificazione del mouse, data della scansione. Acquisire un'immagine localizer per definire l'area di imaging appropriata per tutti e quattro i topi posizionati nel letto.

La scansione localizer è una scansione flash ponderata T1 con una sezione assiale, due fette coronali e due fette sagittali per visualizzare i topi nel letto dei quattro muri. Per impostare la scansione rara T2, si adattano i pacchetti di taglio basati sull'immagine localizzatrice secondo necessità per ottimizzare la visualizzazione della regione del pancreas e di altri organi addominali per il gruppo superiore e inferiore degli animali. Conferma che tutti e quattro i topi siano correttamente allineati nella configurazione multi-animali prima di procedere con la scansione.

Monitorare la respirazione durante le sequenze di imaging e regolare il livello di isoflurano se necessario. Quando la scansione è completata, rimuovi il letto dalla risonanza magnetica. Apri la parte superiore del letto per più animali e rimuovi il monitor respiratorio dal topo in alto a sinistra.

Trasferire gli animali dalla parte superiore e inferiore degli inserti stampati in 3D nella gabbia di recupero. Metti la gabbia di recupero sopra un cuscinetto riscaldante a 42 gradi Celsius per il recupero post-anestesia. Monitorare la frequenza respiratoria e i movimenti per garantire un completo recupero dall'anestesia prima di riportare i topi nelle gabbie domestiche.

Esporta le immagini DICOM da ParaVision 360 a un programma di analisi per ritagliare le immagini da un'immagine con quattro mouse a un'immagine per ogni singolo mouse. In PMOD, apri l'immagine per il set superiore di animali nel modulo Visualizzazione. Nella scheda VOI, disegna una casella intorno al mouse-top a destra, poi ritaglia l'immagine attorno a quella casella.

Modifica i metadati DICOM con l'ID corretto del mouse, poi salva l'immagine creata con il nome file corretto. Ripeti per il mouse in alto a sinistra usando la stessa immagine, poi apri l'immagine per il set inferiore di mouse e ripeti il ritaglio e il salvataggio. Usa un software di visualizzazione per risonanze magnetiche per analizzare le immagini memorizzate nei file DICOM.

Utilizziamo il visualizzatore di risonanza magnetica open source come pacchetto software. Analizza le tacche di imaging dal dorsale al ventrale o dal ventrale al dorsale. Individua organi come milza e stomaco per una corretta localizzazione del pancreas e dei tumori pancreatici.

Definire la regione di interesse in tutte le fette in cui è presente il tumore ed eseguire una segmentazione semi-automatica per calcolare il volume tumorale. Nota le cisti di liquido e altri sintomi ipercromatici. Nell'immagine rappresentativa della risonanza magnetica, possiamo rilevare stomaco, milza e tumore.

La maggior parte dei tumori KPC ha mostrato un solido schema di crescita con un focus unico o predominante, il che ha facilitato il reclutamento per trattamenti e la valutazione del volume tumorale. Tuttavia, abbiamo anche osservato animali con molteplici piccoli tumori solidi diffusi in tutto il pancreas. I tumori PDAC possono anche manifestare un aspetto cistico intratumorale accompagnato da lesioni cistiche paratumorali non neoplasiche o ostruzioni duttali, che possono portare a lesioni contenenti liquido.

Gli studi sui tessuti correlati mostrano concordanza tra la caratteristica tumorale anatomica tramite risonanza magnetica e la caratteristica istologica dei tessuti tumorali della colorazione H&E raccolti immediatamente dopo la sessione di imaging. La regione ipercromatica nella risonanza magnetica compatibile con una lesione piena di liquido corrisponde all'analisi della lesione cistica e istologica. Utilizziamo questa risonanza magnetica multi-animale per monitorare la progressione del tumore pancreatico nel modello KPC trattato con l'agente chemioterapico gemcitabina come prova di concetto preclinico.

La gemcitabina da sola o in combinazione è il trattamento di prima linea per i pazienti con cancro pancreatico locale o metastatico. Gli animali KPC sviluppano tumori pancreatici dopo le 12 settimane di età. Dopo il reclutamento, gli animali furono suddivisi in due gruppi sperimentali.

Primo, ricevere somministrazione intraperitoneale di gemcitabina e un gruppo di controllo senza alcun trattamento. Sono state effettuate risonanze magnetiche settimanali utilizzando il sistema multi-animali a letto, che ci ha permesso di monitorare continuamente le variazioni nella cinetica della crescita tumorale sia nel gruppo di trattamento che in quello di controllo. I nostri dati dimostrano che i tumori nel modello KPC trattato con gemcitabina avevano un modello di crescita più lento rispetto al gruppo di controllo non trattato.

Un risultato sugli animali trattati con gemcitabina è coerente con i precedenti rapporti e conferisce un beneficio di sopravvivenza. Questo protocollo fornisce una piattaforma adatta e solida per studiare terapie combinate di nuovi agenti terapeutici nella chemioterapia standard. Stiamo utilizzando questo protocollo di risonanza magnetica economico per indagare il ruolo di specifici mRNA e PDAC con approcci genetici e farmacologici complementari.

Ma queste terapie combinate possono anche essere inibitori di piccole molecole, immunoterapia, siRNA e altri oligonucleotidi terapeutici contro bersagli molecolari chiave. Sebbene il focus di questo protocollo sia l'imaging del pancreas e di altri organi della cavità addominale, questo protocollo multi-animale e le sequenze MRI descritte possono essere applicati per la caratterizzazione anatomica di altri modelli murini di cancro, come il cancro al seno e il glioblastoma o altre malattie che coinvolgono il rene e/o il fegato. Nel complesso, questo protocollo MRI multi-animale offre una piattaforma rapida, affidabile ed economica per il monitoraggio longitudinale di tumori di alta qualità e la valutazione terapeutica preclinica nei modelli di cancro al pancreas.