Immunocolorazione e esperimenti di penetrazione del colorante per definire le proteine di giunzione settata piegate core nell'epitelio embrionale di Drosophila

La nostra ricerca indaga le funzioni non occludenti dello sviluppo delle proteine di giunzione settato, concentrandosi sull'identificazione e caratterizzazione dei nuovi componenti coinvolti nella struttura e nei ruoli biologici. Questo protocollo è destinato a caratterizzare l'organizzazione e la funzione di occlusione delle giunzioni del setto piegato negli epitelli ectodermici degli embrioni di Drosophila. Per cominciare, incrocia maschi e femmine sani di mosche Drosophila con i genotipi appropriati e collocale in gabbie per la raccolta embrionale con piatti di succo di mela fresco spalmati con pasta di lievito.

Lascia che gli adulti depongano le uova fecondate sui piatti di succo di mela. Rimuovere la piastra dalla gabbia di raccolta delle uova e invecchiare gli embrioni per 13-16 ore dopo la deposizione a 25 gradi Celsius per raggiungere lo stadio 16. Poi fissare gli embrioni di stadio 16 in una soluzione fissativa appropriata ed eseguire l'immunocolorazione con gli anticorpi desiderati.

Per ottenere i migliori risultati, immagini gli embrioni con un microscopio confocale con un obiettivo di immersione in olio di 40x. Dopo aver messo a fuoco sull'embrione di interesse, imposta l'intensità e il guadagno del laser per ottenere un segnale fluorescente forte senza sovrasaturare i pixel. Identificare embrioni di stadio 16 che non esprimono proteine fluorescenti verdi codificate da bilanciatore, utilizzando la morfologia dell'intestino medio.

Focalizzare la scansione sulla ghiandola salivare o sull'intestino posteriore, e posizionare la scansione Z includendo il diametro più grande possibile del lume per visualizzare la membrana laterale completa della cellula epiteliale. Impostare una media lineare adeguata e visualizzare un tessuto polarizzato in almeno 20 embrioni di controllo e 20 embrioni Cora 4 mutanti stadio 16. Registra dati solo da embrioni in cui il marcatore di giunzione di aderenza è strettamente localizzato nella regione apicale-laterale della membrana.

Negli embrioni di tipo selvatico al 16° stadio, si valuta l'arricchimento delle proteine della giunzione del settato piegato lungo la regione apicale della membrana laterale vicino alla giunzione aderente. Registra la distribuzione persistente del marcatore della giunzione piegato del setto lungo tutta la membrana laterale del mutante. Produrre una soluzione di colorante fresca dissolvendo il destrono di 10 kilodalton marcato con rodamina a 1 milligrammo per millilitro in fosfato di sodio 0,5 molari al pH 7,5, con 5 millimolari cloruro di potassio.

Usando un estratore di ago, tira un tubo capillare interno di 1 millimetro di diametro per 0,5 millimetri di diametro interno con fibra, in un ago di vetro. Successivamente, carica l'ago di vetro nel portaago di un micromanipolatore e posiziona il micromanipolatore accanto a un microscopio invertito. Orienta l'ago il più possibile parallelo al vetrino microscopico e abbassalo sullo stesso piano Z del lato del vetrino.

Rompi la punta dell'ago colpendolo contro il lato del vetrino del microscopio. Alza l'ago sopra il livello della slide e rimuovilo per il caricamento. Successivamente, riempi il tubo capillare con il colorante usando la punta più piccola disponibile.

Ricarica l'ago pieno nel portaago. Testare il flusso del destrono da 10 kilodalton iniettando una piccola quantità in una goccia di olio di alocarbonio sulla superficie di un vetrino del microscopio. Utilizzando un anticapo di copertura di 22 x 22 millimetri con spessore numero 2, crea una linea incavata su un piatto di succo di mela.

Allineare circa 25 embrioni ciascuno, di controllo e Cora 4 mutanti, allo stadio 16 o 17, sul piatto di succo di mela. Assicurati che le estremità posteriori siano allineate lungo la linea e che le superfici ventrali siano rivolte verso l'alto. Poi applica un pezzo di nastro bifronte su un copricapo numero 2 da 22 x 22 millimetri.

Tocca il nastro alla linea dell'embrione e strofina leggermente il slip di copertura per trasferire gli embrioni dalla piastra al nastro a doppia faccia. Successivamente, aggiungi una goccia di olio di alocarburi a un vetrino del microscopio e fissa il copertino al vetrino permettendo all'azione capillare di creare un legame. Orienta il coperchio più vicino al lato del carrello opposto a qualsiasi parte sminacciata.

Essiccare gli embrioni per tre-cinque minuti in un contenitore di essiccante e coprire completamente gli embrioni con olio di alocarburi. Montare il vetrino con gli embrioni sul microscopio rovesciato con gli embrioni rivolti verso l'alto e lontani dall'obiettivo. Allinea il micromanipolatore in modo che l'ago sia rivolto verso l'estremità posteriore degli embrioni con un angolo il più possibile parallelo agli embrioni, e regola l'asse Z del micromanipolatore in modo che la punta dell'ago si allinei con il punto medio dell'embrione lungo l'asse dorsale-ventrale.

Successivamente, iniettare gli embrioni spostando rapidamente lo stadio nell'ago in modo che la punta dell'ago entri nell'emocoello. Iniettare circa 0,2-0,5 nanolitri di colorante usando una siringa da 10-25 o 50 millilitri. Ritira rapidamente l'ago e sposta lo stadio al successivo embrione per l'iniezione del colorante.

Poi aggiungi ulteriore olio di alocarburi sugli embrioni. Copri gli embrioni con un anticapo numero 2 da 22 x 22 millimetri per creare uno strato olioso uniforme tra i coperchi e prevenire la frantumazione. Eseguire immagini su un microscopio composto fluorescente o confocale dopo l'iniezione di colorante dextrano.

Al microscopio confocale, si acquisisce una pila Z attraverso circa un quarto della profondità dell'embrione lungo l'asse dorsale-ventrale per valutare il lume della trachea. Esamina il lumen della trachea, una ghiandola salivari o intestino posteriore per l'accumulo di dextran marcato. Registra il genotipo e lo stadio di sviluppo di ciascun embrione e se il destrono marcato si accumula in qualsiasi organo tubolare.

Si noti embrioni in cui lo spazio perivitellino è fortemente colorato con colorante, poiché questi possono rappresentare un'iniezione accidentale in quello spazio. Negli embrioni di tipo selvatico, il complemento macroglobulinico correlato, o Mcr, era uniformemente localizzato lungo la membrana laterale allo stadio 13, si arricchiva nella regione apicale della membrana laterale allo stadio 14 ed era fortemente localizzato nella regione apicale-laterale, appena basale alla giunzione dell'aderenza allo stadio 16. La colorazione corticale degli anticorpi ha definito le giunzioni del setto piegato mature negli embrioni di tipo selvatico dello stadio 16 in modo simile a Mcr.

Negli embrioni mutanti di Cora 4, Mcr non è riuscito a raggiungere una forte localizzazione apicale allo stadio 16 e è rimasto distribuito lungo la membrana laterale. La localizzazione dell'E-cadherin è stata simile negli embrioni di tipo selvatico e Cora 4 mutanti allo stadio 16. Negli embrioni di tipo selvatico dello stadio 17 iniettati con 10 kilodalton dextran marcato con rodamina, il colorante circondava la trachea ma non penetrava il lume.

Negli embrioni di Cora 4 mutanti stadio 17, il colorante si è accumulato nel lumen della trachea entro 10 minuti dall'iniezione. Questo protocollo consente ai ricercatori di determinare con sicurezza se un gene codifica per il nucleo o la componente accessoria delle giunzioni del setto piegato nei tessuti embrionali di Drosophila. La stadiazione embrionale è assolutamente cruciale durante l'esecuzione di questa tecnica, poiché richiede embrioni allo stadio 16.

Le giunzioni del setto maturano nel tempo fino a essere completamente stabilite nella fase 16. Crediamo che questo protocollo possa essere implementato efficacemente nello screening genetico aperto utilizzando linee di interferenza RNA per identificare nuovi geni di giunzione piegata del settato.