Il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da Api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche

Stiamo indagando su come la sovraespressione di una proteina in una linea cellulare non immunogenica porti all'acquisizione di proprietà simili a quelle delle cellule staminali tumorali. Questo protocollo utilizza un mezzo minimo integrato con B-27 ed EGF, rendendolo più conveniente. Per cominciare, ricoprire ogni pozzetto di una piastra standard di coltura tissutale a sei pozzi con un millilitro di soluzione di 1,2% di 2-idrossietil metacrilato e mettere la piastra in un forno a 40 gradi Celsius per asciugare in condizioni sterili.

Esponi il piatto secco alla luce ultravioletta per 15 minuti. Poi, lava ogni pozzo tre volte con il PBS di Dulbecco prima di usare la lastra per impostare il test di formazione della mammosfera. Ottieni una piastra di cellule MCF-10A dissociata 3D precedentemente coltivata e rimuovi il mezzo esaurito.

Lava le cellule con un millilitro di PBS di Dulbecco. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per 12-15 minuti fino a quando le cellule non saranno tripsinizzate. Una volta spostate le cellule, si aggiungono due millilitri di mezzo di risospensione per neutralizzare l'attività della tripsina.

Fai girare la sospensione della cella a 112 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare risultante in un millilitro di mezzo mamosferico. Fai passare la sospensione a cella attraverso un ago calibro 25 per creare una sospensione a singola cella.

Successivamente, usando un emocitometro, contare il numero di cellule. Calcola il volume richiesto della sospensione della cella per produrre 2000 celle per pozzo. Diluire il volume calcolato di sospensione cellulare in due millilitri di mezzo mamassoferico per pozzo e seminare la sospensione diluita in ciascun pozzo di una piastra a sei pozzi, preparando tre pozzi replicati per ogni condizione.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per sette giorni. Dopo sette giorni, si conta manualmente il numero di mammosfere maggiori di 50 micrometri in ciascun pozzo. Immagini le mammosfere usando una fotocamera digitale collegata a un microscopio luminoso a un ingrandimento di 20 x e calcola l'efficienza della formazione della mammosfera usando la formula fornita.

Raccogliere le mammosfere di prima generazione in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspira con attenzione il sovrandante, lasciando intatto il pellet della mammosfera sul fondo del tubo. Lava il pellet con il PBS di Dulbecco.

Centrifugare la sospensione della cella per ottenere un pellet di mammosfera, poi pipetta il PBS del Dulbecco senza disturbare il pellet. Ora, aggiungi 200 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% al pellet lavato e incuba a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per due o tre minuti. Poi, si fanno passare le mammosfere in soluzione di tripsina attraverso un ago calibro 25 tre volte per ottenere una sospensione a singola cellula.

Poi, aggiungi 0,5 millilitri di mezzo di risospensione per neutralizzare l'attività della tripsina. Centrifuga la sospensione a 112 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il sovrantato e risospendere la pellet cellulare in 0,5 millilitri di mezzo mammosferico.

Utilizzando un emocitometro, si conta il numero di cellule e si calcola il volume necessario di sospensione cellulare per produrre 2000 cellule per pozzo. Diluire il volume di sospensione cellulare richiesto in due millilitri di mezzo mammosferico per pozzo e seminare in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi, preparando tre pozzi replicati per ogni condizione. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per sette giorni.

Dopo sette giorni, si contano il numero di mammosfere con diametro superiore a 50 micrometri in ciascun pozzo. Immagini le mammosfere con un ingrandimento di 20 x e calcola la capacità di auto-rinnovamento usando la formula data. Raccogli le mammosfere di prima generazione in un tubo da 15 millilitri e centrifuga a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Aspirare con attenzione il sovrantante, assicurandoti che il pellet di mammosfera rimanga indisturbato sul fondo del tubo. Lava delicatamente il pellet con il PBS di Dulbecco. Dopo aver rimosso il PBS, raccogliere il pellet lavato in un tampone RIPA ghiacciato per ottenere il lisato proteico ed eseguire l'immunoblotting seguendo il protocollo standard.

Infine, quantificare i livelli proteici utilizzando l'analisi densitometrica nell'immagine J. Selezionare la regione di interesse sull'immagine western blot e generare un profilo di densità per ogni corsia e il marcatore di pluripotenza. Normalizza le densità relative della proteina di interesse rispetto a quelle del GAPDH per ogni corsia, poi calcola il cambiamento del piegamento per ogni proteina. Le cellule MCF-10A sovraespresse API5 hanno mostrato un aumento di 1,58 volte nell'efficienza media della formazione della mammosfera rispetto alle cellule di controllo in condizioni non aderenti e prive di siero.

Queste cellule formavano mammosfere di seconda generazione con una capacità di auto-rinnovamento quasi 2,5 volte superiore rispetto a quelle di controllo. L'immunoblotting ha mostrato un aumento dell'espressione di Oct 3/4, Nanog, Sox 2 e BMI1 in API5 rispetto alle mammosfere primarie che esprimono rispetto ai controlli. L'analisi densitometrica ha mostrato un aumento di 1,83 volte nel 4/3 ottobre, un aumento di 1,65 volte in Nanog, un aumento di 1,68 volte in Sox 2 e un aumento di 1,62 volte dei livelli di BMI1 in API5 rispetto alle mammosfere espressive rispetto ai controlli.

Una sfida nel protocollo è la standardizzazione del conteggio cellulare per garantire una formazione sufficiente di mammosfera senza aggregazione cellulare. Le mammosfere generate da questo protocollo possono anche essere utilizzate per visualizzare la localizzazione delle proteine in un contesto tridimensionale utilizzando l'immunofluorescenza.