Name: Il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da Api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri come valutare le proprietà di cellule staminali tumorali nelle cellule epiteliali mammarie MCF-10A mediante il saggio sulla mammosfera. Questo metodo permette di analizzare l'auto-rinnovo e l'espressione dei marcatori di stemness in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Rivestimento delle lastre di coltura tissutale con poli(2-idrossietilmetacrilato), pHEMA
<ol>
	<li>Sciogliere 1,2 g di pHEMA (peso molecolare ̴ 300.000) in 100 mL di etanolo al 95% mescolare costantemente a 65 °C per preparare una soluzione di pHEMA all'1,2% (vedi Tabella dei Materiali).</li>
	<li>Ricoprire le piastre di coltura tissulare standard con pHEMA applicando 1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzi. Il volume della soluzione di pHEMA può essere regolato in base alla dimensione del vaso della coltura tissutale.</li>
	<li>Lascia asciugare i piatti in forno a 40 °C in condizioni sterili.</li>
	<li>Espone le piastre alla luce UV per 15 minuti, seguite da tre lavaggi con la soluzione salina tamponata fosfato (DPBS) di Dulbecco, prima di usarle per preparare il test di formazione della mammosfera.</li>
</ol>
2. Semina delle mammosfere di generazione primaria
<ol>
	<li>Ha ottenuto in coltura cellule MCF10A dissociate 3D (controllo e sovraespressione di Api5) dissociando colture 3D del giorno 16 nel mezzo di crescita14. NOTA: Composizione del mezzo di crescita: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio integrato con siero di cavallo al 5%, 10 μg/mL di insulina, 0,5 μg/mL di idrocortisone, 20 ng/mL fattore di crescita epidermica umana ricombinante (EGF), 100 ng/mL di tossina colera e 200 unità/mL di penicillina-streptomicina (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Rimuovere il mezzo esaurito, lavare le cellule con 1 mL di DPBS, poi aggiungere 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 12-15 minuti finché tutte le cellule non sono tripsinizzate.</li>
	<li>Dopo che tutte le cellule sono state staccate, aggiungi 2 mL di mezzo di risospensione per neutralizzare l'attività della tripsina e fai ruotare la sospensione cellulare a 112 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Composizione del mezzo di risospensione: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio integrato con siero di cavallo al 20% e 200 unità/mL di penicillina-estreptomicina.</li>
	<li>Aspirare il sovrandanante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo mammosferico. Fai passare la sospensione a celle attraverso un ago da 25 G per ottenere una sospensione a singola cella. NOTA: Composizione del mezzo mammosferico: DMEM/F12 integrato con 20 ng/mL di fattore di crescita epidermica (EGF), 1 integratore di B27 × senza vitamina A e 200 unità/mL di penicillina-streptomicina (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Utilizzando un emocitometro, si conta il numero di cellule e si calcola il volume di sospensione cellulare necessario per seminare 0,2 × 104 cellule per pozzo. NOTA: Mantenere una bassa densità di semina per determinare accuratamente l'efficienza della formazione della mammosfera, minimizzando così l'impatto dell'aggregazione cellulare. Quando si raccolgono lisati proteici per l'immunoblotting, la densità cellulare può essere aumentata fino a 2,5 × 105 cellule per pozzo.</li>
	<li>Diluire il volume di sospensione della cella richiesto in 2 mL di mezzo mamasferico e seminare in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzi. Le cellule semi in triplicano per ogni condizione.</li>
	<li>Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% CO2 per 7 giorni.</li>
	<li>Dopo sette giorni di coltura, si contano manualmente il numero di mammosfere con diametro superiore a 50 μm in ciascun pozzo utilizzando un microscopio dotato di graticolo o una griglia a quadranti sotto un microscopio ottico.</li>
	<li>Immagini le mammosfere usando una fotocamera digitale montata su un microscopio luminoso a un ingrandimento di 20x.</li>
	<li>Calcola l'efficienza di formazione della mammosfera (MFE) usando la seguente formula5 
	 <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. Semina delle mammosfere di generazione secondaria
<ol>
	<li>Raccogliere le mammosfere formate nella prima generazione in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspira il surnatante, lasciando la pallina della mammosfera.</li>
	<li>Lava il pellet con DPBS.</li>
	<li>Aggiungi 200 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% al pellet della mammosfera e incuba a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 2-3 minuti. Far passare le mammosfere nella soluzione di tripsina attraverso un ago da 25 G tre volte per ottenere una sospensione a singola cellula.</li>
	<li>Aggiungi 0,5 mL di mezzo di risospensione per neutralizzare l'attività della tripsina e fai girare la sospensione a 112 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il sovrantante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di mezzo mamosferico.</li>
	<li>Utilizzando un emocitometro, si conta il numero di cellule e si calcola il volume di sospensione cellulare necessario per seminare 0,2 ×10-4 cellule per pozzo. NOTA: Mantenere una bassa densità cellulare per valutare la capacità di auto-rinnovamento, minimizzando così l'effetto dell'aggregazione cellulare.</li>
	<li>Diluire il volume di sospensione della cella richiesto in 2 mL di mezzo mamasferico e seminare in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzi. Le cellule semi in triplicano per ogni condizione.</li>
	<li>Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% CO2 per 7 giorni.</li>
	<li>Dopo 7 giorni di coltura, si contano il numero di mammosfere con diametro superiore a 50 μm in ciascuna lamina utilizzando un microscopio dotato di graticola o una griglia a quadranti.</li>
	<li>Immagini le mammosfere usando una fotocamera digitale montata su un microscopio luminoso a un ingrandimento di 20x.</li>
	<li>Calcola la capacità di auto-rinnovamento usando la seguente formula5 
	<img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Western blotting per rilevare i cambiamenti nei marcatori di pluripotenza in caso di sovraespressione di Api5
<ol>
	<li>Raccogliere le mammosfere formate nella prima generazione in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspira il surnatante, lasciando la pallina della mammosfera.</li>
	<li>Lava il pellet con DPBS.</li>
	<li>Raccogliere la pellet in un tampone RIPA ghiacciato per ottenere il lisato proteico ed eseguire l'immunoblotting secondo il protocollostandard 24. NOTA: Composizione del tampone RIPA: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% dodecile solfato di sodio (SDS), 1 mM di acido etilenedilaminacetico (EDTA), 1 mM di fluoruro fenilmetilsulfonile (PMSF), 10 mM di fluoruro di sodio, 1 mM di ortovanato di sodio.</li>
	<li>Rilevare i marcatori di stelo - Oct3/4, Nanog, Sox2 e Bmi1, e il controllo del carico GAPDH (vedi Tabella dei materiali per diluizioni degli anticorpi).</li>
	<li>Quantifica i livelli di proteine usando l'analisi densitometrica su ImageJ. Seleziona la regione di interesse nelle immagini Western blot e genera un profilo di densità per ogni corsia.</li>
	<li>Normalizzare le densità relative della proteina di interesse rispetto a quelle del GAPDH per ogni corsia. Calcola il cambiamento di piegamento per ogni proteina.</li>
	<li>Traccia il cambiamento del piegamento nei livelli proteici usando qualsiasi software di graficazione.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 diluizione, incubazione notturna a 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 diluizione, 1 h incubazione a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 diluizione, incubazione notturna a 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 diluizione, incubazione notturna a 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 diluizione, incubazione notturna a 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Usato per regolare il pH del Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in etanolo</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% acido acetico glaciale</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Dono del Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% etanolo</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Per valutare l'efficienza della formazione della mammosfera in condizioni non aderenti, cellule MCF10A dissociate di controllo e sovraespressive con Api5 sono state seminate su piastre rivestite di poliHEMA secondo il protocollo. Le cellule sovraespressive di Api5 hanno dimostrato un aumento di 1,58 volte nell'efficienza media di formazione della mammosfera rispetto ai controlli (Figura 1B,C). Questo aumento dimostra che un'espressione più elevata di Api5 incrementa la propo...

Il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da Api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Questo video descrive l'isolamento delle cellule staminali tumorali dalle linee cellulari del cancro al seno. Coltiviamo queste cellule staminali tumorali per generare mammosfere primarie per valutare l'auto-rinnovamento e calcolare l'efficienza di formazione delle sfere, consentendo il confronto tra diverse densità di semina.

Generazione di mammosfere primarie: una tecnica per determinare la potenza cellulare

Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi.  Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Lo scopo di questa metodologia è quello di identificare le cellule staminali tumorali (CSC) nelle linee cellulari del cancro e nei campioni tumorali umani primari con il protocollo di formazione della sfera, in modo robusto, utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipica con citometria di flusso e occidentale Macchia.

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Qui, descriviamo l'attuazione e l'interpretazione dei risultati di un saggio quantitativo di auto-rinnovamento della mammosfera in vitro.

Quantificazione dell'autorinnovamento nelle colture di Mammosfera Murine

Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Questo protocollo descrive un approccio scalabile di screening intraductale CRISPR che consente studi paralleli in vivo di knockout e attivazione genica nella ghiandola mammaria del topo.

Screening parallelo in vivo del knockout e attivazione genica nella ghiandola mammaria del topo

Scopri come valutare le proprietà di cellule staminali tumorali nelle cellule epiteliali mammarie MCF-10A mediante il saggio sulla mammosfera. Questo metodo permette di analizzare l'auto-rinnovo e l'espressione dei marcatori di stemness in vitro.

Il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da Api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche

Esplora altri video