Test della barriere fisiologiche di trasmissione virale in Afidi Utilizzando Microiniezione

Se sono trasmettitori efficaci di virus vegetali, e se mediante microiniezione si introducono virus, la procedura che vi mostreremo oggi è una tecnica che consente ai ricercatori di iniettare direttamente il virus nelle cellule ematiche dell'AFib, aggirando l'intestino, una delle due principali barriere per la trasmissione del virus in modo circolativo. Ciao, sono Cecilia Tamrin Dehi, post dottoranda del dipartimento di patologia vegetale della Cornell University. Oggi vi mostrerò come iniettare il virus nelle cellule ematiche dell'AFI, virus che potrà poi essere trasmesso a diverse specie vegetali.

Ad esempio, questa pianta di barbabietola è infettata dal virus della rugosità fogliare della patata (PLRV). È possibile osservare la differenza tra una pianta sana e una infetta. Il sintomo più evidente è la sclerosi fogliare.

Il PLRV è un virus persistente trasmesso dagli afidi nel loro emolinfa, l'equivalente insettino del sangue dei mammiferi. Quando un afide non infetto si nutre su una pianta infetta, contrae il virus attraverso il succo vegetale, come si può vedere qui. Una volta ingerito, il virus deve passare dall'intestino dell'insetto all'emolinfa e successivamente attraversare la ghiandola salivare per essere trasmesso nuovamente alla pianta ospite.

E se per infettare una pianta ESE potrebbero essere necessari molti virus, tuttavia solo una frazione maggiore riuscirà a superare l'intestino e la ghiandola salivare. Le due barriere principali per la trasmissione al fine di infettare più piante da sottoporre a test. Se un AFI è disattivato come vettore di un virus, nutriamo gli AFI con tessuto infetto per due giorni, quindi permettiamo loro di nutrirsi su una pianta sana per cinque giorni.

La pianta viene quindi fumigata e, dopo tre settimane, iniziamo a cercare i sintomi. Quando troviamo un AFib che non è in grado di trasmettere un virus, possiamo determinare quale delle due barriere impedisce la trasmissione virale ricorrendo alla procedura di microiniezione, che vi mostrerò oggi. In questa procedura, il virus viene iniettato direttamente nell'emocellula, aggirando così la barriera della trasmissione intestinale.

Quindi cominciamo e vi mostrerò come microiniettare alcuni apici. Questo è il vetro, gli aghi di vetro che utilizziamo. Tiriamo gli aghi di vetro da queste barrette di vetro usando APU apu.

Questo è il microiniettore. Per effettuare la microiniezione di un virus, inizierò a inserire l'ago nel portaago.

Quindi inserisco semplicemente l'ago e lo posiziono. Ora procederò a caricare il virus nell'ago fino all'estremità superiore di questo manico. Ora dobbiamo posizionare l'AFI per la microiniezione.

Prenderò quindi un AFI con la pressione dolorosa e lo posizionerò nel supporto per AFI. Idealmente, cercherò di posizionare la parte posteriore dell'afide contro il supporto, in modo da poter accedere alla parte addominale dell'AFib. Ok, perfetto.

Ora possiamo procedere con la microiniezione. Ok, ora posizionerò l'ago e lo avvicinerò all'AFib. Adesso porterò l'ago a contatto con l'AFib e lo userò per perforare l'esoscheletro; la cosa migliore è cercare di penetrare tra i segmenti alla base delle zampe.

Pertanto procederò all'iniezione. Ora sto prelevando l'AFI con il pennello e lo sto ponendo sulla carta assorbente, dove lo lascerò asciugare per un momento. Dobbiamo inoltre microiniettare l'AFI di controllo.

Questa microiniezione di controllo viene eseguita solo con il tampone, senza il virus. Il tampone che utilizziamo è un tampone fosfato 0,1 M a pH 7. Pertanto, inserirò l'afi in una pianta sana, dove lo lascerò per cinque giorni; successivamente, sottoporrò la pianta alla microiniezione dell'RNA a filamento negativo e attenderò lo sviluppo dei sintomi. Durante la settimana successiva, ogni giorno verrà misurato il livello di espressione del gene bersaglio nell'afi.

Quindi abbiamo appena microiniettato un afide che non era in grado di trasmettere il virus. Se, dopo la microiniezione, l'afide è in grado di trasmettere il virus, significherà che questo afide possiede una barriera intestinale che bloccava il virus. Se invece non si sviluppano sintomi, significherà che questo afide ha una barriera delle ghiandole salivari particolarmente efficace.

Quindi abbiamo appena mostrato come microiniettare il virus all'interno dei afidi. Questa stessa procedura viene utilizzata per microiniettare l'RNA a filamento singolo nei afidi al fine di eseguire l'interferenza dell'RNA, una tecnica interessante che aiuta nello studio della funzione genica nei afidi. Questo è tutto per quanto riguarda la microiniezione.

Spero che vi piaccia e che sia utile per i vostri esperimenti. Grazie.