Profilazione fenotipica dei fenotipi comportamentali simili a Parkinson indotti da MPTP nelle larve di pesce zebra, basata su un esperimento comportamentale

Presentiamo un protocollo comportamentale multiparametrico per profilare in modo completo i fenotipi motori e non motori parkinsoniani nelle larve di pesce zebra. Questo protocollo si applica alla modellazione della malattia di Parkinson, allo screening farmacologico, alla neurotossicità ambientale, agli studi che utilizzano le larve di pesci. Per cominciare, indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali protettivi.

Diluire una soluzione di 100x E3 a un rapporto uno a 100 con acqua ultrapura per preparare un mezzo a singola concentrazione. Ora seleziona maschi e femmine di pesce zebra adulti sessualmente maturi. Utilizzando vasche di riproduzione con divisori rimovibili, esegui riproduzione controllata.

Alle 20:00, posizionare maschi e femmine di pesci zebra in sezioni separate delle vasche di riproduzione con un rapporto di due maschi per tre femmine, utilizzando dei divisori per tenerli separati. La mattina seguente alle 8:00, rimuovere i divisori per permettere l'accoppiamento. Raccogli gli embrioni un'ora dopo e lavali tre volte con acqua pulita.

Conservare gli embrioni in piastre di Petri da 100 millimetri contenenti 20 millilitri di mezzo E3 fresco. Poi incubare gli embrioni a 28 gradi Celsius con un ciclo di luce di 14 ore e un ciclo di buio di 10 ore. Un giorno dopo la fecondazione, rimuovere con cura embrioni non fecondati, malformati e anomali utilizzando una pipetta da pascolo.

Aspirare lentamente il mezzo dal bordo della piastra di Petri e aggiungere nuovo mezzo embrionale E3 lungo la parete della piastra di Petri per minimizzare il disturbo agli embrioni di tipo selvatico. Per il gruppo trattato con MPTP, si utilizza la soluzione di 50 micromolari di MPTP. Quattro giorni dopo la fecondazione, modifica una pipetta da pascolo da tre millilitri tagliando 10 millimetri dalla punta per creare un canone largo.

Alle 18:00, utilizzare la pipetta modificata per selezionare le larve di pesce zebra da ogni gruppo e trasferire una larva per pozzo in una piastra da 96 pozzi. Osserva ogni pozzo al microscopio stereoscopico per confermare che ogni larva di pesce zebra appare sana. Verifica che le pinne siano aperte e oscillino regolarmente, che il corpo sia eretto e che la scala da nuoto sia gonfiata.

Successivamente, pulisci con attenzione la parte inferiore della piastra per evitare che lo sporco influenzi i risultati del video tracking. Poi trasferire la piastra a 96 pozzi centralmente sul fondo della camera della scatola zebra. Seleziona la modalità quantizzazione nel software di tracciamento video.

Per il monitoraggio della regolazione della veglia in sonno, imposta la regolazione della luce per spegnere la luce alle 22:00 e accenderla alle 8:00. Configura i parametri software in modo che la soglia di rilevamento sia impostata a 40, il burst a 25, il blocco a quattro, il tempo totale di monitoraggio a 52 ore e poi la dimensione a 60 secondi. Inizia la procedura di veglia a sonno alle 8:00 PM.To monitora le risposte fotomotorie, posiziona le larve cinque giorni dopo la fecondazione in una piastra da 96 pozzi con una larva per pozzo. Poi imposta il programma di transizione della luce da zero a 60 secondi di oscurità, seguito da 60-120 secondi di luce costante.

Avvia il protocollo e raccogli i parametri di movimento ogni sei secondi durante i 120 secondi di analisi. Ferma il protocollo a 120 secondi ed esporta il file dati. Poi si posizionano le larve in completa oscurità per cinque minuti per ambientarle al successivo test di luce stroboscopica scura.

Imposta il programma di transizione luminosa per fornire luce stroboscopica a 10 hertz per 60 secondi. Per valutare la thigmotassi, seleziona due piastre a sei pozzi. Riempi ogni pozzo con quattro millilitri di mezzo E3.

A cinque giorni dalla fecondazione, raccogliere le larve di pesci zebra dal gruppo selvatico e dal gruppo trattato con MPTP e collocarle in sei piastre di pozzo separate. Prima della valutazione della thigmotassi, posizionare le piastre del pozzo nella scatola zebra per 15 minuti per consentire l'acclimatazione. Poi si utilizza la funzione area di assorbimento per tracciare due cerchi concentrici in ciascun pozzo con il raggio del cerchio interno pari a metà del raggio del pozzo, e inizia la valutazione.

Per una valutazione locomotoria, trasferire larve di pesci zebra di cinque giorni dal gruppo selvatico e dal gruppo trattato con MPTP in due lastre separate da 12 pozzi. Dopo un'acclimatazione di 15 minuti, seleziona la modalità di analisi online di tracciamento e registra l'attività locomotoria per cinque minuti utilizzando il sistema automatizzato di tracciamento video. Per il test di risposta allo scolpo, trasferire le larve di cinque giorni singolarmente in due piastre da 12 pozzi con una larva per pozzo e due millilitri di mezzo E3.

Metti i piatti nella scatola di zebra per un periodo di acclimatazione leggera di cinque minuti. Avvia il software ZebraLab e attiva la modalità di analisi online di tracciamento. Apri l'interfaccia di innesco della luce, poi seleziona, usa uno dei tre metodi di attivazione qui sotto e attiva gli stimoli potenziati.

Poi, imposta il metodo di inizio su quando inizia la sessione. Nel programma di transizione, definisci il ritmo del flash scuro. Imposta il programma per farlo attivare dopo 21 secondi, poi imposta la transizione da uno a cinque millisecondi con intensità luminosa al 100%.

Transizione da due a 2, 890 millisecondi con intensità luminosa del 100%. Transizione da tre-cinque millisecondi con 0% di intensità luminosa, e transizione da quattro a 100 millisecondi con 0% di intensità luminosa. Spunta la casella per la lista ripetuta delle transizioni per garantire lampeggiamenti periodici, e poi avvia il protocollo.

Per il saggio di sfida a scure chiare, trasferire le larve di pesce zebra in due piastre da 24 pozzi con una larva per pozzo e un millilitro di mezzo E3. Dopo cinque minuti di acclimatazione nella scatola zebra, attiva la modalità di analisi di tracciamento online. Poi configura il programma di luce per sei minuti di luce costante, seguiti da quattro minuti di completa oscurità.

Al decimo minuto, ferma la registrazione comportamentale e salva i dati. Rimuovi con attenzione il piatto dalla scatola di zebra. Dopo ogni esperimento comportamentale, spruzzare e pulire tutte le superfici a contatto con il MPTP con una soluzione di ipoclorito di sodio appena preparata.

Raccogli rifiuti liquidi e solidi contenenti MPTP e etichettali chiaramente come rifiuti neurotossici pericolosi. Tratta tutti i materiali contaminati con una soluzione di ipoclorito di sodio appena preparata. Le larve di pesce zebra trattate hanno mostrato tracce di sonno e attività di veglia interrotte rispetto al gruppo di tipo selvatico.

Il tempo totale di sonno è aumentato significativamente anche nel gruppo trattato. Il numero di dormite fuori è diminuito significativamente nel gruppo trattato, mentre la durata media delle uscite è aumentata. L'attività in veglia e l'attività media erano significativamente compromesse nel gruppo trattato.

Con luce costante, l'indice di congelamento del gruppo trattato aumentava significativamente. È aumentato significativamente anche sotto stimolazione con luce stroboscopica a 10 hertz. Le curve di risposta fotomotoria hanno mostrato una reattività ridotta nel gruppo trattato.

I risultati di tracciamento indicarono una riduzione del comportamento locomotorio ed esplorativo nel gruppo trattato. Anche il nuoto totale e la velocità media di nuoto sono stati significativamente ridotti nel gruppo trattato. Il rapporto di tempo di movimento di congelamento era significativamente più alto nel gruppo trattato, ma il rapporto di tempo di movimento rapido era significativamente più basso.

Transizioni alternate tra luce e oscurità produssero picchi di velocità pronunciati nelle larve di tipo selvatico. La distanza nuotata dopo la stimolazione e la velocità massima dopo la stimolazione sono state significativamente ridotte nel gruppo trattato. La latenza all'inizio della velocità massima di movimento era anch'essa significativamente ritardata nel gruppo trattato.

La sfida principale è minimizzare i determinanti interni tenendo conto della variabilità individuale per garantire un'analisi comportamentale accurata e riproducibile a livello di pesce zebra. Il clustering comportamentale e il profiling fenomico possono essere applicati per scoprire effetti neurotossici sottili e ottenere intuizioni magnetiche più profonde. Studi futuri potranno applicare questa piattaforma allo screening di farmaci approvati a rischio e alla valutazione farmacologica nei modelli di morbo di Parkinson del pesce zebra.