Sequenziamento metagenomico di nuova generazione del liquido cerebrospinale per la rilevazione di patogeni del sistema nervoso centrale

Questo è un protocollo basato sulla ricerca per il sequenziamento metagenomico di nuova generazione di campioni di liquido cerebrospinale, al fine di consentire la rilevazione di potenziali patogeni all'interno del campione. I protocolli MNGS esistenti non tengono conto della bassa resa di RNA all'interno del LCR. Questo protocollo ottimizza diversi passaggi per tenere conto della bassa biomassa presente in questi campioni.

Per iniziare a scongelare i campioni di liquido cerebrospinale sul ghiaccio, trasferire 100 microlitri a un millilitro di ciascun campione in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugare a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Poi si pipetta con cura il surnatante, lasciando la pellet e 100 microlitri di surnadante. Aggiungi 100 microlitri di schermo DNA RNA ai restanti 100 microlitri del surnatante e del pellet e mescola accuratamente.

Poi aggiungi 600 microlitri di tampone di lisi di DNA RNA e mescola pipettando finché la soluzione non diventa omogenea. Esegui il protocollo di estrazione di DNA e RNA secondo le istruzioni del produttore con le seguenti importanti modifiche. Eseguire tutti i passaggi di centrifugazione per un minuto alla massima velocità, eccetto il lavaggio finale del DNA RNA, che deve essere centrifugato per tre minuti.

Per eluire il campione, aggiungere 22 microlitri di acqua priva di nucleasi direttamente sulla matrice della colonna. Poi incuba per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo la pipetta elluciana, il flusso torna sulla matrice della colonna, centrifuga nuovamente per un minuto alla massima velocità prima di trasferire il campione in un nuovo tubo di stoccaggio da 1,5 millilitri.

Pipetta i componenti necessari per la frammentazione e la priming dell'RNA in un tubo PCR. Incubare il tubo in un termociclatore con il coperchio riscaldato impostato a 105 gradi Celsius. La pipetta mescola l'RNA frammentato e primizzato con otto microlitri di acqua priva di nucleasi e due microlitri di miscela enzimatica di sintesi a primo filo.

Incubare il tubo in un termociclatore con il coperchio riscaldato impostato a 105 gradi Celsius. Poi si mescola il DNA sintetizzato dal primo filamento con 48 microlitri di acqua priva di nucleasi. Otto microlitri di tampone per la reazione di sintesi del secondo filamento e quattro microlitri di miscela enzimatica per la sintesi del secondo filamento.

Metti il tubo in un termociclatore e incuba per un'ora a 16 gradi Celsius con il coperchio riscaldato spento. Successivamente, eseguire la purificazione delle sfere magnetiche utilizzando un rapporto di 1,8 volte tra le sfere magnetiche a immobilizzazione reversibile in fase solida. Eludi il campione in 53 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Trasferire 50 microlitri del CDNA doppio filamento purificato contenente supernatante finale in un tubo PCR pulito senza nucleasi. A questo punto, i campioni possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Se il campione è stato conservato a meno 20 gradi Celsius durante la notte, scongelarlo sul ghiaccio prima di ricominciare.

Miscela per pipete 50 microlitri di CDNA a doppio filamento purificato con sette microlitri di tampone per la reazione di preparazione finale e tre microlitri di miscela enzimatica per la preparazione finale. Mettere i campioni in un termociclatore e incubare a 20 gradi Celsius per 30 minuti e 65 gradi Celsius per 30 minuti con il coperchio riscaldato spento. Successivamente, esegui il passaggio di ligatura dell'adattatore sul ghiaccio creando prima una diluizione da uno a 100 dell'adattatore in acqua priva di nucleasi.

Pipetta la miscela di reazione di preparazione finale in un tubo contenente 30 microlitri di miscela master di legazione, un microlitro di potenziatore di legatura e 2,5 microlitri dell'adattatore diluito. Mettere i campioni in un termociclatore e incubare a 20 gradi Celsius per 15 minuti con il coperchio riscaldato spento. Dopodiché, si procede immediatamente alla purificazione delle sfere magnetiche utilizzando un rapporto 0,9 volte delle sfere magnetiche a immobilizzazione reversibile in fase solida.

Poi eludi in 17 microlitri d'acqua priva di nucleasi. Trasferire 15 microlitri del supernante finale in un tubo PCR pulito senza nucleasi. Ora l'adattatore purificato a pipette ha legato il CDNA in un tubo con tre microlitri di enzima utente, 25 microlitri di miscela master Q 5 e 10 microlitri di primer unici con codice a barre.

Inserire il tubo in un termociclatore con il coperchio riscaldato impostato a 105 gradi Celsius e incubare alle condizioni presentate. Esegui una purificazione finale delle sfere magnetiche usando un rapporto di 0,8 volte delle sfere magnetiche. Poi eludi il campione in 23 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Trasferire 20 microlitri del supernante finale in un tubo PCR pulito senza nucleasi. Quantificare la concentrazione delle librerie di campioni utilizzando un kit di quantificazione del DNA e il corrispondente fluorimetro. Verifica che i controlli idrici abbiano concentrazioni sostanzialmente più basse o non quantificabili rispetto agli altri campioni.

Valuta le dimensioni della libreria dei campioni facendo passare i campioni su una macchina automatica per l'elettroforesi capillare. Utilizza la piattaforma web open source Chan Zuckerberg ID per eseguire analisi metagenomiche per la rilevazione dei patogeni. Accedi all'ID di Chan Zuckerberg e clicca su carica.

Seleziona metagenomica come tipo di analisi e scegli i file FASTQ in input dalla sequenza. Inserisci le informazioni richieste sul campione, inclusi il nome del campione, il tipo di campione (LCR) e il tipo di nucleotide RNA o DNA. Una volta completato l'elaborazione, clicca sulla cartella del progetto contenente i campioni e naviga alla dashboard riassuntiva.

Scorri verso il basso per esaminare il numero di letture per campione. Rivedere la percentuale di letture che superano il filtro di controllo qualità e il rapporto di compressione duplicato per valutare eventuali PCR distorte sovraamplificazioni. Per determinare eventuali contaminazioni da DNA estraneo all'interno della cartella del progetto, seleziona ogni campione di controllo dell'acqua e clicca su modello di fondo per generare il modello.

Durante l'analisi, applica il modello e utilizza filtri a soglia per impostare un punteggio NTZ superiore a uno e rimuovere i contaminanti probabili. Poi analizza i dati utilizzando un software statistico appropriato. I dati dell'elettroforesi capillare e dell'elettroferogramma hanno dimostrato una libreria di campioni CDNA sovraframmentata e contenente dimeri adattatori non destinati al sequenziamento.

La libreria CDNA senza contaminazioni significative da dimer da adattatore era pronta per il pooling e il sequenziamento. Il sequenziamento di nuova generazione metagenomica del CSF ha rilevato diversi patogeni nella coorte A e B, con almeno un patogeno nel 73,5% dei campioni della coorte A e nel 51,2% dei campioni della coorte B. Una sfida chiave è la pipettura precisa a causa dei bassi volumi insieme all'asciugatura sensibile al tempo, dove un'essiccazione insufficiente o eccessiva può compromettere i risultati.

Sebbene questo protocollo specifico sia focalizzato sul lato di rilevamento dei patogeni, i trascrizioni di RNA ospite generate da questo protocollo possono essere utilizzate per ulteriori analisi a valle. Quindi è importante per studi futuri confrontare le prestazioni di questo particolare protocollo di preparazione e sequenziamento delle librerie con i metodi emergenti progettati anche per campioni scarsi, per vedere come si confronta non solo in termini di rilevamento dei patogeni, ma anche per analisi trascrictoriche.