Valutazione funzionale della barriera epiteliale gingivale del topo utilizzando traccianti fluorescenti

Questo è un protocollo standardizzato per la valutazione quantitativa dell'integrità della barriera epiteliale gengivali. Questo protocollo è utile per studiare le malattie da disfunzione della barriera e per testare farmaci rigeneranti della barriera nella gengiva. Per cominciare, dividere i maschi di topi selvatici di tipo C57BL/6J in tre gruppi: un gruppo di controllo non trattato, un gruppo di parodontite indotta da legatura e un gruppo di parodontite indotta da Porphyromonas gingivalis.

Seleziona traccianti fluorescenti con spettri non sovrapposti, come il destrono marcato FITC e il dextrano marcato con rodamina B. Per diluire i tracciatori, miscela un grammo per litro ciascuno di FD40 e RD70 in un gel di carbossilcellulosa al 2%. Conserva la miscela preparata sul ghiaccio.

Dopo aver confermato la profondità anestetica tramite il riflesso di pizzicamento del dito dei piedi, usa un bavaglio per tenere aperta la cavità orale del topo anestetizzato. Applicare 50 microlitri della miscela tracciante preparata topicamente sulla superficie gengivale labiale della regione molare. Lascia la miscela al suo posto per 30 minuti e riapplica se ingoietta.

Dopo 30 minuti di applicazione del tracciante, fissa il topo in posizione supina su cartone e fissa gli arti con del nastro adesivo per immobilizzare l'animale. Successivamente, aprire la cavità orale del topo soppresso e isolare il mascellare. Rimuovi delicatamente i tessuti circostanti e risciacqua accuratamente il campione con PBS.

Posiziona la mascella isolata su un vetrino di vetro. Poi posiziona la plastilina da modellare su entrambi i lati per stabilizzare e fissare il copertino sopra il campione. Posizionare con cura il mascellare dissezionato sul portacampioni progettato su misura per garantire una posizione stabile per l'immagini.

Utilizzando un microscopio verticale a singolo fotone dotato di un obiettivo a immersione in acqua 25X. Concentrati sulla regione di supporto montata sotto la mascella e acquisisci immagini. Seleziona la regione di interesse sulla superficie buccale del secondo molare all'interno del mascellare e inizia tempestivamente l'immagini.

Acquisire immagini Z-stack con una dimensione di un micrometro, partendo dalla superficie gengivale fino a una profondità da 100 a 200 micrometri per la ricostruzione tridimensionale. Nel software, clicca su file e seleziona nuova cartella per creare una nuova cartella per il set di dati e assegnare un nome descrittivo. Nella scheda acquisizione, imposta il formato XY su 512 per 512 con una risoluzione di 0,99 micrometri per pixel.

Poi imposta il fattore zoom a uno. Successivamente, imposta le lunghezze d'onda di eccitazione a 488 nanometri e 561 nanometri. Configurare finestre di emissione rispettivamente a 500-550 nanometri e da 570 a 620 nanometri.

Per la serie Z e l'imaging tridimensionale, seleziona la modalità acquisizione ND. Imposta il passo Z su un micrometro e regola se necessario. Dopo aver configurato i parametri, seleziona la modalità live per visualizzare l'area gingivola nei singoli canali di fluorescenza e in quelli fusi.

Poi clicca su esegui ora per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Per misurare la permeabilità, si separano l'intensità di fluorescenza di FD40 e RD70 in canali diversi. Unisci le fette dell'asse Z senza sottrazione di fondo.

Poi utilizza il software ImageJ per quantificare l'intensità di fluorescenza e valutare la permeabilità della barriera epiteliale. Clicca su file e seleziona aperta per aprire l'immagine della mascella in ImageJ. Poi premi immagine e cambia il tipo di immagine in formato a 8 bit per l'analisi.

Clicca su analizza, seleziona imposta le misure. Poi controlla area, media e densità integrata, e clicca su ok per confermare. Poi seleziona il canale desiderato e regola la soglia cliccando sull'immagine, scegliendo aggiusta e selezionando soglia.

Abilita l'opzione sfondo scuro per tenere conto degli sfondi neri. Clicca su analizzare e seleziona le misure impostate. Poi controlla il valore grigio medio e il limite alla soglia, e conferma cliccando ok.

Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, traccia manualmente il contorno della regione del segnale fluorescente sul lato del tessuto gengivali. Clicca su analizzare e seleziona misura per ottenere valori di intensità di fluorescenza dove la densità integrata rappresenta l'intensità di fluorescenza. Copia i risultati delle misurazioni in un foglio di calcolo per calcoli e grafici.

Calcola l'intensità media di fluorescenza del gruppo di controllo nel foglio di calcolo. Dividere il valore di intensità di fluorescenza di ogni gruppo sperimentale per la media del gruppo di controllo per ottenere l'intensità relativa di fluorescenza. Nel gruppo di controllo, entrambi i traccianti fluorescenti erano in gran parte confinati alla superficie gengivalica.

Sia nei gruppi trattati con legatura che in quelli trattati da Porphyromonas gingivalis, è stata osservata una significativa estravasione sia di FD40 che di RD70 nell'epitelio gengivalico. L'analisi semi-quantitativa ha mostrato un aumento significativo dell'intensità di fluorescenza sia di FD40 che di RD70 nei gruppi trattati con la legatura e Porphyromonas gingivalis. L'imaging 3D ha rivelato una distribuzione di fluorescenza dei tracce più estesa e diffusa attorno alla vascolatura gengivale nella ligatura, e Porphyromonas gingivalis ha trattato gruppi rispetto ai controlli.

Questo protocollo quantifica la permeabilità e l'integrità della barriera paracellulare gengivale del topo. Questo protocollo può essere combinato con micro-CT per l'analisi multimodale delle immagini. Ulteriori studi possono esplorare farmaci di riparazione della barriera e meccanismi molecolari nelle malattie orali.