Name: Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri l'isolamento, la coltivazione e la trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare CAR-T. Questo protocollo dettagliato utilizza l'elettroporazione di mRNA per testare rapidamente costrutti CAR in immunoterapia.

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<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>Per isolamento per gravità</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>Coniugato: PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>Coniugato: APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>Coniugato: PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>Coniugato: PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>Coniugato: PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>Coniugato: APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Per isolamento per gravità</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>Coniugato: VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>Coniugato: Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>Coniugato: Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>Coniugato: VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>Coniugato: FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>Per isolamento per gravità</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72,380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1–2.5 μL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100–1000 μL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2–20 μL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20–200 μL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>Per isolamento per gravità</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>Per isolamento per gradiente di densità</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>con modulo PC e modulo CE</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Per isolamento per gravità</td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 μg)</td><td>New England Biolabs</td><td>T2040S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Spin PCR &amp; DNA Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T1130S</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinet</td><td>Thermo Scientific</td>

isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule t primarie umane per generare cellule t del recettore antigenico chimerico (car)

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Attivazione ed espansione delle cellule T primarie umane Le cellule T primarie sono state scongelate e attivate al giorno 0 con globuli CD3/28 o TransAct, espanse per 23 giorni e contate ogni 2-3 giorni (Figura 2A). Nei giorni di conteggio, le densità cellulari sono state regolate a 0,3-0,5 x 106 cellule/mL. Nei giorni 0/2/5/9/14/20, le cellule T sono state utilizzate per l'analisi citometrica a flusso per valutare il fenotipo e l'espressione dei marcatori di attivazione. Entro la prima settimana dall'attivazione, le cellule T proliferarono ed espansero rapidamente con entrambi i reagenti di attivazione (Figura 2B), con un'espansione di pieghe leggermente inferiore nei giorni successivi per le cellule T attivate da TransAct (Figura 2C). In particolare, l'attivazione delle cellule T è stata visibile anche tramite analisi microscopica, con cluster di cellule T che si formano attorno ai reagenti di attivazione (Figura 2D).
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Attivazione ed espansione delle cellule T primarie utilizzando due diversi reagenti di attivazione. (A) Rappresentazione schematica della linea temporale sperimentale. Le cellule sono state attivate con perle CD3/28 o TransAct al giorno 0 e coltivate per 23 giorni. I puntini blu rappresentano i giorni in cui le cellule sono state contate, i puntini rossi i giorni in cui le cellule sono state analizzate tramite citometria di flusso, e i puntini viola indicano i giorni in cui entrambe le analisi sono state effettuate. (B) e (C) espansione delle cellule T primarie durante (B) la prima settimana o (C) entro 16 giorni dalla coltura. I valori indicano la deviazione media ± standard di 4 (CD3/28 perle) o 3 (TransAct) diversi donatori sani di cellule T sane. (D) Immagini microscopiche rappresentative delle cellule T attivate con raggruppamento cellulare visibile nei giorni 1 e 2 dopo l'attivazione. Le immagini sono state scattate con un microscopio rovesciato. Il righello corrisponde a 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Colorazione del fenotipo e dei marcatori di attivazione delle cellule T Per l'analisi citometrica in flusso, è stata applicata la seguente strategia di gating (Figura 3): È stato applicato un primo gate (FSC-Altezza vs. SSC-Altezza) per rimuovere detriti cellulari e perle, seguito dal gating per singole celle (FSC-Larghezza vs. SSC-Area). La percentuale di celle CD3+ dovrebbe essere nell'intervallo del 98-100%. Ulteriori sotto-gating hanno fornito la percentuale di cellule T CD4 + (helper) e CD8+ (citotossiche), che sono state ulteriormente selezionate per diversi sottoinsiemi fenotipici di cellule T utilizzando i marcatori CD45RA e CD62L. Le cellule T CD3+ sono state inoltre analizzate per l'espressione dei marcatori di attivazione (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Strategia di gating per l'analisi citometrica a flusso. Sono mostrati i dot plot rappresentativi di un donatore di cellule T attivato con perle CD3/28 al giorno 5 (n = 4). Abbreviazioni; TEMRA = celle di memoria effettori T che riesprimono CD45RA; TSCM = cellule T a memoria simili a cellule staminali; TEM = cellule T della memoria effettore; TCM = cellule T della memoria centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Dopo l'attivazione con le sfere CD3/28, la percentuale di cellule T CD4+ rispetto a quelle CD8+ è diminuita nel tempo, con il 74,3% (± 7,4%) delle cellule T CD4+ al giorno 5, che è diminuito al 14,6% (± 3,4%) al giorno 20 dopo l'attivazione. Le cellule T CD8+ sono aumentate dal 20,7% (± 6,4%) al giorno 5 all'82,4% (± 3,1%) al giorno 20 (Figura 4A). Tendenze simili sono state rilevate dopo l'attivazione con TransAct, con percentuali leggermente inferiori di cellule T CD8+ al giorno 20 (72,5% ± 0,7%). Pertanto, l'espansione leggermente più lenta delle cellule T osservata dopo l'attivazione con TransAct corrispondeva a una percentuale più bassa di celle CD8+ e a una percentuale più alta di celle CD4+ durante il periodo di espansione. Le differenze nella composizione fenotipica delle cellule T erano simili per entrambi i reagenti di attivazione (Figura 4B). Tuttavia, le frequenze delle cellule di memoria effettori T che riesprimono CD45RA (TEMRA) erano complessivamente più elevate per le celle CD8+ rispetto a quelle CD4+ . In concordanza, le cellule T CD4+ hanno mostrato percentuali più elevate di cellule T a memoria centrale (TCM) e cellule T a memoria simili a cellule staminali (TSCM) (Figura 4B).
CD134 è stato l'unico marcatore di attivazione già aumentato dopo lo scongelamento delle cellule T, con il 37,6% (± 4,1%) delle cellule T CD134+ attivate con sfere CD3/28 e il 36,1% (±4,4%) delle cellule T CD134+ per le cellule T attivate da TransAct (Figura 4C). In entrambe le strategie di attivazione, CD25, CD69 e CD134 erano fortemente aumentati al secondo giorno. Per le perle CD3/28, l'espressione CD69 e CD134 ha raggiunto il picco al giorno 2, mentre CD25 ha raggiunto il picco al giorno 5. Risultati simili sono stati osservati per le cellule T attivate da TransAct. CD134 e CD154 sono stati aumentati solo al giorno 14 sia per le sfere CD3/28 sia per le cellule attivate da TransAct. Nel complesso, le tendenze osservate sono state molto simili tra i due reagenti di attivazione. Tuttavia, l'espressione di CD69 al giorno 14 era leggermente più alta nelle cellule T attivate con CD3/28 rispetto alle loro controparti TransAct (97,1% ± 0,9% contro 86,5% ± 5,1%). Questo corrisponde al prolungato tasso di espansione elevato osservato nelle cellule attivate da perle CD3/28. In sintesi, il pannello dei marcatori di attivazione proposto include marcatori che vengono aumentati sia nei primi che nei momenti successivi dopo l'attivazione, con sensibilità variabile tra i diversi marcatori di attivazione, ma nel complesso, tendenze simili per entrambi i reagenti di attivazione.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Analisi del fenotipo delle cellule T e dell'espressione dei marcatori di attivazione con diversi reagenti di attivazione durante un periodo di coltivazione di 20 giorni. (A) Percentuali di cellule T CD4+/CD8+ durante la coltivazione dopo l'attivazione con perle CD3/28 (a sinistra) o TransAct (a destra). (B) Differenziazione delle cellule T dopo l'attivazione con perle CD3/28 (due pannelli sinistri) o TransAct (due pannelli destra), ciascuno per celle CD4+ o CD8+. Il fenotipo è stato valutato utilizzando i marcatori CD45RA e CD62L. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA- CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (C) Espressione dei marcatori di attivazione dopo l'attivazione con perle CD3/28 o TransAct e durante il periodo di espansione. Vengono mostrate frequenze [%] della popolazione madre delle cellule T CD3+ (media ± deviazione standard di 4 [globuli CD3/28] o 3 [TransAct] diversi donatori sani di cellule T sane). Abbreviazioni; TEMRA = celle di memoria effettori T che riesprimono CD45RA; TSCM = cellule T a memoria simili a cellule staminali; TEM = cellule T della memoria effettore; TCM = cellule T della memoria centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Transfezione transitoria delle cellule T primarie e analisi dell'espressione di CAR Le cellule T primarie sono state trasfettate con mRNA tramite elettroporazione al giorno 7 dopo l'attivazione con sfere CD3/28 o TransAct. Come modello, è stato utilizzato mRNA che codifica per un CAR di seconda generazione che mira il proteoglicano 4 del solfato di condroitina (CSPG4) con un dominio co-stimolante CD28 e un dominio di segnalazione CD3ζ. È stato incluso un DYKDDDDK-tag (flag-tag) per consentire il rilevamento citometrico a flusso. La vitalità delle cellule T e l'espressione della CAR sono state valutate 3, 6, 24 e 48 ore dopo l'elettroporazione. La colorazione è stata eseguita come descritto nella sezione 6 del protocollo.
Sebbene la vitalità sia delle cellule T attivate da perle CD3/28 che di quelle attivate da TransAct fosse bassa 3 ore dopo l'elettroporazione, complessivamente la vitalità delle cellule CAR T trasfettate variava dal 51 all'85% e non differiva significativamente tra le due strategie di attivazione (Figura 5A). Il CAR era già rilevabile a questo punto precoce dopo l'elettroporazione. Sebbene la percentuale di cellule CAR+ sia diminuita gradualmente nel tempo, la frequenza più alta di celle CAR+ era rilevabile entro 24 ore dopo l'elettroporazione (Figura 5B, pannello sinistro). In particolare, l'intensità del segnale è rimasta stabile nelle prime 6 ore dopo l'elettroporazione e è diminuita gradualmente successivamente (Figura 5B, pannello destro). L'espressione CAR era quasi assente dopo 48 ore, dimostrando la natura transitoria della manipolazione cellulare e l'importanza di scegliere una finestra temporale precoce per i saghi a valle. I dot plot rappresentativi per l'espressione CAR di un donatore sono mostrati nella Figura 5C. Per entrambi i reagenti di attivazione, il rapporto CD4/CD8 non è differito tra cellule CAR e MOCK-trasfettate (Figura 5D). In linea con i nostri precedenti risultati, le cellule T attivate con le sfere CD3/28 mostravano una frequenza leggermente superiore di cellule T CD8+ rispetto a quelle attivate con TransAct. Per l'analisi fenotipica, viene mostrato un donatore rappresentativo a causa delle grandi variazioni dipendenti dal donatore (Figura 5E). Sebbene sia il reagente di attivazione sia lo stato CD4/CD8 influenzino il fenotipo delle cellule T, l'espressione di CAR non provoca un cambiamento nel fenotipo rispetto alle cellule trasfettate tramite MOCK.
Per valutare l'influenza della concentrazione di mRNA sui livelli di espressione, le cellule T primarie sono state trasfettate con mRNA codificante per una versione mutante di GFP (muGFP) utilizzando 0,1, 0,3, 1, 3 o 6 μg di mRNA. Il segnale GFP è stato misurato tramite citometria di flusso 24 ore dopo l'elettroporazione. Come previsto, quantità già basse di mRNA di 0,1 μg portarono a un segnale rilevabile di GFP, con un aumento graduale dell'intensità del segnale con l'aumentare delle quantità di mRNA. Nei nostri esperimenti, 1 μg di mRNA era già saturo, e quantità maggiori (3 e 6 μg di mRNA) non hanno portato a un aumento del segnale GFP (Figura 5F). Questo evidenzia la possibilità di utilizzare quantità variabili di mRNA per titolare i livelli di espressione, il che può essere utile per testare l'influenza di diversi livelli di espressione antigenica CAR- o addiritturabersaglio 28.
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Cinetica di espressione delle CAR e analisi fenotipica delle cellule CAR T trasfettate. (A) Vitalità delle cellule T CAR dopo l'elettroporazione con mRNA codificante per CAR. 2 μL di 7-AAD in 100 μL di tampone di colorazione sono stati utilizzati per valutare la vitalità dopo 10 minuti di incubazione. n = 2-3 donatori individuali (B) Colorazione per l'espressione di CAR con un anticorpo anti-DYKDDDDK (coniugato con APC, diluizione finale 1:50). Dopo il gating sulle cellule vitali, è stata analizzata la percentuale di cellule CAR-positive rispetto ai controlli trasmessi con MOCK (pannello sinistro) o l'intensità mediana geometrica della fluorescenza (GeoMedia, pannello destro) dell'intera popolazione. Sono mostrate medie di n = 3 donatori individuali ± S.D. (C) Dot plot rappresentative di un donatore da (B) che dimostrano la cinetica dell'espressione CAR nel tempo. (D) Analisi delle cellule T CD4+/CD8+ e confronto tra le cellule T trasfettate da MOCK e le cellule T trasfettate da CAR e due diverse strategie di attivazione 24 ore dopo l'elettroporazione. Sono mostrate medie di n = 3 donatori individuali ± S.D. (E) Analisi fenotipica delle cellule T trasfectate con MOCK e CAR mostrate in (B) 24 ore dopo l'elettroporazione. Viene mostrato un donatore rappresentativo di n = 3. (F) Analisi dell'espressione di muGFP 24 ore dopo l'elettroporazione con diverse quantità di mRNA. Il gating per le cellule vive è stato effettuato prima che la GeoMedia per la GFP fosse quantificata. Sono mostrate medie di n = 3 donatori ± abbreviazioni S.D.; CAR = recettore antigenico chimerico; mRNA = acido ribonucleico messaggero; 7-AAD = 7-aminoactinomica; RT = temperatura ambiente; muGFP = proteina fluorescente verde mutante; S.D. = deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

To assess the efficacy and potency of chimeric antigen receptor (CAR) T cells, it is essential to isolate, activate, expand, characterize, and genetically ...

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Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR) (Video) | JoVE Journal

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

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