Flusso di lavoro di crio-tomografia elettronica per tessuti spessi dimostrato nell'ippocampo del topo

La mia ricerca si concentra sull'istituzione di un flusso di lavoro standardizzato crio-ET per consentire l'analisi strutturale in situ di tessuti spessi come l'ippocampo del topo. I metodi esistenti mancano di affidabilità per tessuti spessi, quindi questo protocollo integra passaggi ottimizzati per un'analisi standardizzata. Per cominciare, posiziona una goccia da 10 L di soluzione al 10% di saccarosio su una superficie di vetro pulita.

Dissezionare rapidamente l'ippocampo da un topo appena soppresso. Utilizzando una lametta affilata, si tagliano piccoli pezzi di tessuto da 0,5 a 1 millimetro cubo. Utilizzando uno stuzzicadenti o uno spazzolino fine, trasferisci il tessuto sulle griglie TEM di supporto in rame preparate all'interno del portatore di congelamento ad alta pressione.

Usa il 2-metilpentano per mantenere il tessuto umido e regolarne la posizione sulla griglia, minimizzando allo sforzo meccanico per evitare danni alla griglia. Poi, copri il tessuto e la griglia con un disco di lamina di rame di 3 millimetri di diametro. Per completare l'assemblaggio, posizionare il secondo supporto per congelamento ad alta pressione, con il lato piatto verso il basso, sopra per formare un sandwich sigillato per il waffle.

E controlla i parametri di congelamento per assicurarti che non ci siano anomalie nello strumento. Assicurati che il tempo totale dalla dissezione del tessuto al congelamento non superi i 90 secondi. Ottenere una nuova griglia d'oro da 300 mesh per servire come griglia ricevente finale per la procedura di sollevamento.

Sotto un microscopio stereo a temperatura ambiente, inserire delicatamente la griglia in un anello AutoGrid crio-FIB compatibile. Successivamente, conserva l'AutoGrid assemblato direttamente in un forno a secco, mantenuto a circa 40 gradi Celsius, per minimizzare l'accumulo di gelo prima dell'uso. Mentre immergi continuamente l'insieme nell'azoto liquido, separare con cura la griglia TEM vetrificata dai componenti circostanti del gruppo waffle.

Utilizzando pinzette a punta fine pre-raffreddate, separare delicatamente i due portatori di congelamento ad alta pressione. Successivamente, su una postazione di lavoro con caricamento criogenico pre-raffreddata, montare la griglia di tessuto isolato in un secondo anello AutoGrid crio-FIB sotto la protezione dell'azoto liquido. Carica entrambi gli AutoGrid negli slot designati del portacampioni dello shuttle crio-trasferito.

Orientare ogni AutoGrid in modo che la tacca di fresatura sia rivolta verso l'esterno e posizionata verticalmente per consentire un angolo di fresatura più basso. Mantenere lo shuttle completamente carico immerso in azoto liquido o mantenuto in uno stato pre-raffreddato fino al trasferimento nel FIB-SEM. Caricare lo stadio campione nello strumento usando la barra campione.

Dopo il crio-trasferimento al microscopio, navigare verso la griglia tissutale a basso ingrandimento SEM. Poi, si spruzza la superficie della griglia con platino a 30 milliampere per 15 secondi per fornire una protezione conduttiva. Depositare un tappo organometallico in platino spesso 0,5-1,0 micrometri utilizzando il sistema di iniezione di gas per circa 60 secondi.

Applica uno strato finale di platino rivestito a sputter sulla superficie della griglia a 30 milliampere per 15 secondi. Utilizzando l'immagine del fascio di elettroni SEM, naviga verso la regione di interesse selezionata sulla griglia tissutale. Per orientare il campione per la fresatura frontale, regolare lo stadio a circa 110 gradi di rotazione e 7 gradi di inclinazione per presentare la superficie del campione con un angolo adatto all'accesso al fascio di ioni.

Per la fresatura a trince, si definisce una trincea rettangolare che circonda il blocco tessutale bersaglio utilizzando il fascio ionico azionato a 30 kilovolt. Iniziare la fresatura a distanza dal blocco utilizzando una corrente relativamente elevata di 15 nanoamperi per ottenere una rapida rimozione del materiale. Quando le pareti della trincea si avvicinano al blocco fino a pochi micrometri, si riduce la corrente del fascio ionico a 7 nanoampere per ottenere un controllo della fresatura più preciso.

Lascia un lato del blocco attaccato al materiale sfuso per creare una linguetta temporanea. Per blocchi di tessuto con spessore stimato superiore a 20 micrometri, eseguire un passaggio di fresatura sottotagliata dal lato opposto per facilitare il sollevamento finale. Ruota il palco e regola l'inclinazione per accedere al fondo del blocco.

Fresa la connessione inferiore usando il fascio di ioni focalizzato a 30 kilovolt e una corrente di 3 nanoamperi. Fresa il fondo del blocco metallico per farlo aderire saldamente al blocco campione. Fresa con precisione la superficie di contatto tra il campione e il blocco d'oro per rendere il contatto più stretto.

Per attaccare il campione all'ago, assicurati che il blocco d'oro sia a contatto diretto con il campione bersaglio. Utilizzando il fascio di ioni focalizzato a 30 kilovolt e 0,5 nanoampere, esegui da 8 a 12 schemi di fresatura a sezione trasversale sequenziale all'interfaccia per saldare il blocco d'oro al campione. Per sollevare il blocco tessutale, si recide la linguetta rimanente che collega il blocco al campione di massa utilizzando il fascio di ioni focalizzato.

Manovrare con attenzione l'ago del micromanipolatore per sollevare completamente il blocco di tessuto isolato dalla trincea e dalla griglia circostante. Ritrai l'ago e trasporta il blocco alla griglia del ricevitore. Naviga l'ago del micromanipolatore fino a una griglia di ricevitore oro pre-raffreddata da 300 megli.

Abbassa il blocco su una casella a griglia scelta. Scava via piccoli cristalli di ghiaccio sulla griglia per far aderire meglio il blocco e la griglia di tessuto. Abbassa il blocco di tessuto in modo che entri solo in contatto con la griglia.

Fresare una fetta spessa 3-4 micrometri dal blocco sulla pellicola a griglia usando il fascio di ioni. Successivamente, saldare la fetta in modo sicuro tramite fresatura, utilizzando schemi di sezione trasversale pulita su entrambi i lati della giunzione, e reapplicare il rivestimento conduttivo e protettivo sulla superficie della griglia come dimostrato in precedenza. Per il diradamento delle lamelle, dopo aver impostato l'inclinazione dello stage, si definisce la posizione finale della lamella all'interno di un'area liscia del blocco tissutale.

Eseguire fresatura sistematica utilizzando correnti di fascio ionico e compensazioni di sovrainclinazione specificate nella tabella presentata. Quando si trova entro 1-2 micrometri dalla lamella, opzionalmente fresare una trincea di sollievo dello stress a circa 1,5 micrometri di distanza per evitare che la lamella si pieghi o si pieghi. Dopo la preparazione della lamella, acquisire immagini utilizzando la criomicroscopia elettronica.

I blocchi tissulari processati tramite congelamento ad alta pressione con il metodo waffle mostravano un aspetto uniforme e trasparente agli elettroni. Tomogrammi ricostruiti hanno risolto le strutture mitocondriali all'interno dell'ambiente cellulare. I complessi macromolecolari, come i ribosomi, erano chiaramente risolti nel citoplasma.

Caratteristiche cellulari del citoscheletro e associate alla membrana e complessi polari nucleari erano visibili anche nei tomogrammi ricostruiti. Strutture e caratteristiche sinaptiche, inclusi depositi di calcio e strutture della guaina mielinica, erano chiaramente viste nei tomogrammi. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare direttamente la struttura cellulare esterna nativa all'interno di ambienti tissutali complessi.

La sfida più critica in questo protocollo crio-ET è ottenere una vitrificazione uniforme e priva di artefatti di campioni di tessuto spesso. Seguendo questa procedura, i ricercatori possono localizzare le regioni di interesse utilizzando tecniche di microscopia a luce e elettronica correlativa o di marcatura, quindi eseguire la media sub-tomogrammatica e l'analisi strutturale per risolvere complessi macromolecolari.