Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore
7 luglio 2026
Lo studio attuale descrive un flusso di lavoro per il sequenziamento nanoporo dei plasmidi quando la sequenza cromosomica è già nota o non ha alcun interesse. Un primo passaggio di arricchimento del DNA plasmidico garantisce una profondità ottimale della sequenza plasmidica e massimizza il numero di campioni che possono essere sequenziati per cella di flusso.
Indaghiamo la replicazione, il mantenimento e la diffusione di elementi circolari autoreplicanti del DNA, noti come plasmidi, che richiedono la determinazione delle loro sequenze. Questo protocollo affronta le questioni di copertura e accuratezza associate al sequenziamento a lettura lunga arricchendo il DNA plasmidico e ottimizzando i metodi di assemblaggio. Il nostro protocollo è progettato per sequenziare plasmidi in situazioni in cui la sequenza cromosomica è nota o irrilevante.
Per cominciare, stria i campioni su piastre LB con coclea integrate con l'antibiotico appropriato per selezionare il rispettivo marcatore di resistenza trasmesso dal plasmide. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, inoculare da tre a cinque millilitri di LB medium integrato con l'antibiotico appropriato con una singola colonia isolata.
Incubare la coltura con scuotimento a 37 gradi Celsius per circa otto ore o fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge uno o due. Poi inoculare 400 millilitri di LB integrato con l'antibiotico appropriato con 400 microlitri della coltura iniziale e incubare come dimostrato in precedenza. Successivamente trasferisci la coltura in bottiglie centrifughe adatte al volume di coltura.
Centrifugare a 4.200 G per 10 minuti e risospendere il pellet utilizzando i volumi di reagente raccomandati dal produttore. Dopo la lisi e la neutralizzazione cellulare, centrifugare il lisato a 4.200 G per 30 minuti. Trasferisci il soprandanzante in un nuovo tubo e centrifugalo di nuovo.
Esegui equilibrio, lavaggio ed eluzione del DNA secondo le istruzioni del produttore. Poi risospendi il DNA precipitato in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi per massimizzare la concentrazione necessaria alla preparazione della libreria di nanopori. Successivamente, per quantificare il DNA, preparare i tubi di analisi secondo la tabella presentata.
Dopo aver calibrato il fluorometro, inserire i tubi campione nel fluorometro e registrare le letture secondo il manuale degli strumenti. Programma il termociclatore a 30 gradi Celsius per due minuti, seguito da 80 gradi Celsius per due minuti. Centrifuga e mescola i componenti del kit scongelati come indicato nella tabella presentata.
Incubare i tubi PCR preparati per il codice a barre utilizzando il programma thermal cycler. Poi metti i tubi sul ghiaccio per raffreddarli. Raccogli i campioni con codice a barre in un tubo Eppendorf pulito da 1,5 millilitri, assicurandoti che il volume totale non superi 1.000 microlitri.
Una volta che le perle sono state vortizzate, aggiungi un volume uguale di perle ai campioni con codice a barre aggregati. Mescola facendo sbattere il tubo, seguito da un'incubazione di 10 minuti. Poi lava le sfere con un millilitro di etanolo all'80% mentre si usa sul magnete.
Rimuovi l'etanolo e ripeti una volta. Rimuovi il tubo dal magnete. Sospezione delle perle nel buffer di eluzione utilizzando il volume appropriato in base al numero di codici a barre utilizzati e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quantificare la concentrazione di DNA utilizzando un microlitro del campione eluso sul fluorometro per confermare la preparazione della libreria riuscita a essere risolta. Per la ligatura degli adattatori, trasferire 11 microlitri della libreria di DNA in un nuovo tubo e etichettarlo. Poi mescola i componenti presentati in un tubo nuovo per diluire l'adattatore rapido scongelato.
Successivamente, aggiungi un microlitro di adattatore rapido diluito alla libreria di 11 microlitri di DNA e muovi il tubo per mescolare il contenuto. Fai girare brevemente il tubo per assicurarti che il volume completo si accumuli sul fondo e incubare il tubo sul banco per cinque minuti. Prepara la miscela di priming per celle di flusso in un tubo di DNA fresco e mescola tramite inversione e pipettatura.
Solleva il coperchio del dispositivo e inserisci la cella di flusso applicando una pressione delicata per garantire la corretta posizione. Dopo aver controllato la presenza di bolle d'aria all'interno o adiacenti alla porta di innesco, preleva indietro da 20 a 30 microlitri di liquido per rimuovere le bolle. Poi preleva 800 microlitri di miscela per l'innesco e la dispensi nella porta di innesco evitando bolle d'aria e lascia riposare il dispositivo per cinque minuti.
Mescola la libreria di DNA con il volume appropriato di perle della biblioteca in un nuovo tubo come presentato qui. Carica 200 microlitri di miscela di priming nella porta di priming della cella di flusso. Regola il coperchio della porta campione per rivelare la porta.
Erogare 75 microlitri della libreria di DNA con le sfere nel porto del campione, una goccia alla volta, permettendo a ciascuna goccia di assorbirsi prima di aggiungere la successiva. Poi riapplica il coperchio della porta campione e chiudi la porta di innesco. Una volta chiusa la copertura del dispositivo, inizia la sequenza.
Imposta il limite di runtime in base al numero di plasmidi multiplexati con un valore predefinito di 48 ore e un massimo di 72 ore. Seleziona la modalità di chiamata base super precisa e l'opzione di kit di codice a barre rapido appropriata. Poi seleziona i dati grezzi FAST5 o POD5 e inizia a chiamare la base.
Per generare un file FASTQ filtrato per l'assemblaggio a valle, si tagliano le lunghe letture usando Filtlong per rimuovere circa il 5-10% delle letture di qualità inferiore mantenendo circa il 90% della resa totale. Il sottocampione si legge usando Autocycler secondo le impostazioni consigliate. Assembla ogni sottoinsieme di lettura usando Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler e altri assembler selezionati.
Visualizza ogni file grafico dell'assemblaggio usando la benda. Valutare i contigi per circolarità, consistenza di dimensioni tra assemblatori e evidenza di giunzioni chimeriche. Rimuovere contig lineari privi di supporto su più assembler e mantenere contig circolari con stime di dimensione costanti.
Rimuovere contigi minori non supportati prima della generazione di consenso quando i plasmidi principali sono circolarizzati. Procedere alla generazione del consenso dopo la curazione manuale. Genera la sequenza di consenso usando Autocycler con gli assembly curati.
Esegui i restanti comandi Autocycler per produrre la sequenza finale del plasmide consensuale. Infine, rifinitura l'assemblaggio finale usando letture lunghe tagliate con Medaka per migliorare l'accuratezza del consenso. Tutti i saggi di coniugazione producevano transconiuganti, confermando la presenza di un plasmide coniugativo nei donatori.
Le dimensioni delle sequenze plasmidiche assemblate erano congruenti con le stime basate sulla mobilità dell'elettroforesi del gel del campo d'impulso. Il sequenziamento nanopore ha prodotto un'uscita di lettura e una qualità sufficienti per tutti i campioni analizzati. I tassi di contaminazione cromosomica variavano tra il 72,1% e il 28,0% con una media del 46,9%. L'analisi elettroforesi con gel di campo a impulsi del plasmide dello strain UPEC_271 rivelato una banda corrispondente a un plasmide di circa 145 coppie di kilobase.
Il DNA di uno dei transconiuganti mostrava una sequenza identica a quella delle 145 kilobase. L'analisi elettroforesi con gel di campo pulsante del sangue di deformazione 100913 identificato due plasmidi di circa 70 e 110 coppie di kilobase. Il sequenziamento nanoporo ha confermato due assemblaggi plasmidi di 71.182 coppie di basi e 111.226 coppie di basi.
La considerazione più importante è se la sequenza cromosomica sia di interesse. Se sì, i protocolli standard di sequenziamento del genoma completo sono migliori. La copertura aumentata del nostro protocollo apre la porta allo studio dell'eteroplasmia, cioè
variazione della sequenza plasmidiale all'interno di una data popolazione.
Panoramica
Questo articolo presenta un flusso di lavoro dettagliato per il sequenziamento nanopori, progettato per massimizzare il rendimento di DNA plasmidico e l'accuratezza del sequenziamento. Il protocollo comprende l'estrazione del plasmide, la marcatura rapida con barcode, la ligazione degli adattatori, il sequenziamento e l'assemblaggio delle sequenze, ed è adatto a un'ampia gamma di dimensioni plasmidiche e livelli di contaminazione cromosomica. Il metodo viene dimostrato utilizzando Escherichia coli come organismo modello.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Genomica
- Microbiologia
Sfondo
- Il sequenziamento del plasmide è essenziale per studi genetici, l'espressione genica ricombinante e esperimenti di cattura del plasmide.
- I metodi tradizionali di sequenziamento possono essere limitati dalla contaminazione cromosomica e da una bassa resa del plasmide.
- Il sequenziamento con nanopori offre capacità di lettura lunga e acquisizione dati in tempo reale.
- Sono necessarie procedure efficienti per ottimizzare la produttività e l'accuratezza del sequenziamento del plasmide.
Scopo dello studio
- Sviluppare e descrivere un flusso di lavoro robusto per il sequenziamento di plasmidi basato su nanopori.
- Massimizzare il rendimento del DNA plasmidico e l'accuratezza del sequenziamento.
- Consentire un sequenziamento parallelo efficiente di più campioni.
Metodi Utilizzati
- Estrazione del DNA plasmidico da ceppi clinici di E. coli.
- Preparazione delle librerie mediante barcoding rapido e ligazione degli adattatori.
- Caricamento delle librerie su una flow cell a nanopori per il sequenziamento.
- Chiamata delle basi eseguita in tempo reale o in un secondo momento.
- Assemblaggio delle sequenze mediante Autocycler.
- Confronto degli assemblaggi con la mobilità su gel e assemblaggi corretti con letture corte.
Risultati principali
- Le dimensioni degli assemblaggi plasmidici corrispondevano a quelle dedotte dalla mobilità su gel.
- In due terzi dei casi, gli assemblaggi corrispondevano o assomigliavano strettamente ad assemblaggi rifiniti con letture corte (identità pari o superiore al 99,95%).
- Il protocollo supporta plasmidi di dimensioni comprese tra 4 e 174 kb.
- È tollerata fino al 72% di contaminazione cromosomica senza perdita di accuratezza.
- È possibile effettuare il sequenziamento parallelo di fino a 24 campioni con copertura ottimale.
Conclusioni
- Il flusso di lavoro consente un sequenziamento accurato ed efficiente di plasmidi mediante tecnologia nanoporosa.
- È adatto alla verifica di plasmidi, al miglioramento di sequenze di plasmidi ottenute tramite WGS e al sequenziamento di plasmidi catturati mediante coniugazione.
- Il protocollo è robusto rispetto alla contaminazione cromosomica e applicabile a un'ampia gamma di dimensioni di plasmidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sequenziamento nanopori di plasmidi con letture lunghe consente una verifica e un assemblaggio ad alta affidabilità delle costruzioni plasmidiche, supportando controlli di qualità essenziali e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica. Questo flusso di lavoro affronta la sfida della contaminazione cromosomica e del rendimento variabile del plasmide, fornendo soluzioni solide e scalabili per lo sviluppo di DNA ricombinante e vettori per terapia genica. La sua capacità di parallelizzazione e la tolleranza a input di DNA misti ottimizzano i flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta e preclinica, migliorando il processo decisionale sul portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente la verifica precisa di plasmidi ingegnerizzati per studi funzionali e la convalida di bersagli.
- Riduce l'ambiguità nell'identità del costrutto, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nella biologia della scoperta.
- Facilita il rapido triage di costrutti candidati per successivi screening o espressione.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce dati di sequenza validati per plasmidi pronti per il saggio, garantendo la riproducibilità nelle campagne di screening.
- Consente il sequenziamento parallelo di fino a 24 campioni, aumentando la produttività per le librerie di costrutti.
- Offre un'accuratezza quantitativa della sequenza, permettendo confronti affidabili tra varianti ingegnerizzate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Migliora la continuità dalla fase di scoperta a quella preclinica confermando l'integrità del plasmide in sistemi pertinenti alla malattia.
- Consente la verifica della sequenza per plasmidi utilizzati in studi di trasferimento genico o di biomarcatori.
- Supporta un avanzamento basato sulla valutazione del rischio riducendo le incertezze legate alla sequenza nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro basato su nanopori integra la verifica iniziale del costrutto fino alla selezione e alla validazione preclinica, sostenendo sia le linee di ricerca ipotetiche che quelle traslazionali.
- Biologia della scoperta: Conferma la fedeltà della sequenza del plasmide, riducendo il rischio di effetti fuori bersaglio nei saggi funzionali.
- Screening: Garantisce che i costrutti pronti per il saggio siano stati verificati mediante sequenziamento, supportando una valutazione riproducibile dei composti.
- Analisi: Fornisce dati di sequenza quantitativi ad alta accuratezza per il confronto tra campioni e per il controllo di qualità.
- Ricerca traslazionale: Allinea la verifica della sequenza del plasmide ai requisiti dei modelli preclinici per studi sull'espressione genica.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità di sequenziamento scalabile e parallelizzabile, adattabile a diversi programmi di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi basati su costrutti e riduce l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizza la verifica dei plasmidi, tollera un'elevata contaminazione cromosomica e supporta flussi di lavoro ad alto rendimento.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di prosecuzione/cessazione garantendo l'integrità del costrutto prima di investimenti successivi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di asset basati su geni in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'estrazione di plasmidi, nella preparazione di librerie e nei flussi di lavoro di sequenziamento nanoporo.
- Richiede un'infrastruttura computazionale proporzionata alle esigenze di basecalling in tempo reale o post-hoc.
- Traggo vantaggio da protocolli standardizzati per la riproducibilità tra gruppi di lavoro e la confrontabilità dei dati.
- Adattabile a diverse dimensioni di plasmidi e contesti cellulari ospiti, inclusi quelli con elevato contenuto di DNA cromosomico.
- Particolarmente adatto per applicazioni in cui la sequenza cromosomica è nota o non necessaria.
