Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore
July 7th, 2026
Lo studio attuale descrive un flusso di lavoro per il sequenziamento nanoporo dei plasmidi quando la sequenza cromosomica è già nota o non ha alcun interesse. Un primo passaggio di arricchimento del DNA plasmidico garantisce una profondità ottimale della sequenza plasmidica e massimizza il numero di campioni che possono essere sequenziati per cella di flusso.
Indagiamo sulla replicazione, la manutenzione e la diffusione di elementi di DNA circolare autoreplicanti, noti come plasmidi, che necessitano la determinazione delle loro sequenze. Questo protocollo affronta i problemi di copertura e precisione associati al sequenziamento a lettura lunga arricchendo il DNA plasmidico e ottimizzando i metodi di assemblaggio. Il nostro protocollo è progettato per sequenziare i plasmidi in situazioni in cui la sequenza cromosomica è nota o irrilevante.
Per iniziare, distribuire i campioni su piastre LB auger integrate con l'antibiotico appropriato per selezionare il rispettivo marcatore di resistenza portato dal plasmide. Incubar le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, inoculare tre-cinque millilitri di mezzo LB integrato con l'antibiotico appropriato con una singola colonia isolata.
Incubare la coltura con agitazione a 37 gradi Celsius per circa otto ore o fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge uno-due. Quindi inoculare 400 millilitri di mezzo LB integrato con l'antibiotico appropriato con 400 microlitri della coltura di partenza e incubare come dimostrato in precedenza. Quindi trasferire la coltura in bottiglie di centrifuga adeguate per il volume della coltura.
Centrifuga a 4.200 G per 10 minuti e risospendere il pellet utilizzando i volumi di reagente raccomandati dal produttore. Dopo la lisi cellulare e la neutralizzazione, centrifugare il lisato a 4.200 G per 30 minuti. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo e centrifugare nuovamente.
Eseguire l'equilibriatura, il lavaggio e l'eluzione del DNA secondo le istruzioni del produttore. Quindi risospendere il DNA precipitato in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi per massimizzare la concentrazione per la preparazione della libreria nanopore. Poi, per quantificare il DNA, preparare i tubi del test come indicato nella tabella presentata.
Dopo aver calibrato il fluorometro, inserire i tubi del campione nel fluorometro e registrare le letture secondo il manuale dell'apparecchiatura. Programmare il termociclatore a 30 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 80 gradi Celsius per due minuti. Far girare e mescolare i componenti del kit scongelati come indicato nella tabella presentata.
Incubare i tubi PCR preparati per il barcode utilizzando il programma del termociclatore. Quindi posizionare i tubi sul ghiaccio per raffreddare. Unire i campioni barcode in un tubo Eppendorf pulito da 1,5 millilitri, assicurandosi che il volume totale non superi 1.000 microlitri.
Una volta che le perle sono state agitate, aggiungere un volume uguale di perle ai campioni barcode uniti. Mescolare facendo oscillare il tubo, seguito da un'incubazione di 10 minuti. Quindi lavare le perle con un millilitro di 80% di etanolo mentre sono sul magnete.
Rimuovere l'etanolo e ripetere una volta. Rimuovere il tubo dal magnete. Risospendere le perle nel buffer di eluizione utilizzando il volume appropriato basato sul numero di barcode in uso e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quantificare la concentrazione del DNA utilizzando un microlitro del campione eluito sul fluorometro per confermare la preparazione della libreria di successo. Per la legatura degli adattatori, trasferire 11 microlitri della libreria di DNA in un nuovo tubo e etichettarlo. Quindi mescolare i componenti presentati in un tubo fresco per diluire l'adattatore rapido scongelato.
Quindi aggiungere un microlitro di adattatore rapido diluito ai 11 microlitri di libreria di DNA e far oscillare il tubo per mescolare il contenuto. Far scendere brevemente il tubo per assicurarsi che il volume completo si raccolga sul fondo e incubare il tubo in banco per cinque minuti. Preparare la miscela di priming del flusso cellulare in un tubo di DNA fresco e mescolare per inversione e pipettaggio.
Sollevare il coperchio del dispositivo e inserire il flusso cellulare all'interno applicando una leggera pressione per assicurare il corretto posizionamento. Dopo aver controllato la presenza di bolle all'interno o adiacenti alla porta di priming, aspirare 20-30 microlitri di fluido per rimuovere le bolle. Quindi aspirare 800 microlitri di miscela di priming e distribuirlo nella porta di priming evitando bolle d'aria e lasciare che il dispositivo si sieda per cinque minuti.
Mescolare la libreria di DNA con il volume appropriato di perle della libreria in un nuovo tubo come presentato qui. Caricare 200 microlitri di miscela di priming nella porta di priming del flusso cellulare. Regolare il coperchio della porta del campione per rivelare la porta.
Distribuire 75 microlitri della libreria di DNA con perle nella porta del campione una goccia alla volta, permettendo a ogni goccia di assorbire prima di aggiungere la successiva. Quindi riapplicare il coperchio della porta del campione e chiudere la porta di priming. Una volta chiuso il coperchio del dispositivo, avviare la corsa di sequenziamento.
Impostare il limite di tempo di esecuzione in base al numero di plasmidi multiplexati con un valore predefinito di 48 ore e un massimo di 72 ore. Selezionare la modalità di chiamata della base super accurata e l'opzione del kit di barcode rapido appropriata. Quindi selezionare i dati FAST5 o POD5 grezzi e avviare la chiamata delle basi.
Per generare un file FASTQ filtrato per l'assemblaggio a valle, tagliare le letture lunghe utilizzando Filtlong per rimuovere circa il 5-10% delle letture di qualità inferiore mantenendo circa il 90% della resa totale. Sottocampionare le letture utilizzando Autocycler secondo le impostazioni consigliate. Assemblare ogni sottoinsieme di letture utilizzando Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler e altri assemblatori selezionati.
Visualizzare ogni file grafico dell'assemblaggio utilizzando bandage. Valutare i contig per la circularità, la coerenza dimensionale tra gli assemblatori e l'evidenza di giunti chimerici. Rimuovere i contig lineari privi di supporto su più assemblatori e conservare i contig circolari con stime dimensionali coerenti.
Rimuovere i contig minori non supportati prima della generazione del consenso quando i plasmidi maggiori sono circularizzati. Procedere alla generazione del consenso dopo la curatela manuale. Generare la sequenza di consenso utilizzando Autocycler con gli assemblaggi curati.
Eseguire i comandi rimanenti di Autocycler per produrre la sequenza finale del plasmide di consenso. Infine, lucidare l'assemblaggio finale utilizzando letture lunghe tagliate con Medaka per migliorare l'accuratezza del consenso. Tutti i test di coniugazione hanno prodotto transconiugati, confermando la presenza di un plasmide coniugante nei donatori.
Le dimensioni delle sequenze plasmidiche assemblate erano congruenti con le stime basate sulla mobilità dell'elettroforesi su gel a campo pulsato. Il sequenziamento Nanopore ha prodotto un'uscita di lettura e una qualità sufficienti per tutti i campioni analizzati. I tassi di contaminazione cromosomica variavano tra il 72,1% e il 28,0% con una media del 46,9%. L'analisi dell'elettroforesi su gel a campo pulsato del plasmide della linea UPEC_271 ha rivelato una banda corrispondente a un plasmide di circa 145 kilobasi.
Il DNA di uno dei transconiugati mostrava una sequenza ident
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
