Name: Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri il sequenziamento e l'assemblaggio di plasmidi a lunga lettura con flussi di lavoro nanopore per biologia molecolare. Questo metodo ottimizza la resa del DNA plasmidico e la precisione del sequenziamento utilizzando Escherichia coli.

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<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf DNA LoBind tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP022431081</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>1.5 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>15 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>250 mL sterile flasks&nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424R-PR-R</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R-P-R</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Centrifuge bottles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1283-4EA</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Disposable Inoculating Loops: 1 &micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Electronic Digital Scale</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-355-720</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Ethanol-resistant markers</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Flow cell (R10.4.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Wash Kit&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>Qualsiasi marchio di guanti in nitrile funziona</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP26184</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>MinION Sequencing Device&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MIN-101B</td><td></td></tr><tr><td>Native Barcoding Kit 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra MIDI Plasmid DNA Extraction Kit</td><td>Takara</td><td>740410.5</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube racks</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>&nbsp;R96PCRFSP</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>PCR tubes: (0.2 mL)</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Program autocycler v0.5.2</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bcftools v1.22</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools team)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bwa v0.7.19</td><td>Heng Li, originally at the Broad Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program canu v2.3</td><td>University of California, Davis &amp; Pacific Biosciences collaborators</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program flye v2.9.6</td><td>University of California, San Diego (Pavel Pevzner lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program medaka v2.1.1</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program metamdbg&nbsp;v1.2</td><td>INRIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program miniasm v0.3</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minimap2 v2.28</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minipolish&nbsp; v0.2.0&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program porechop v0.2.4</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program racon v1.5.0</td><td>Genome Institute of Singapore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program samtools v1.22.1</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools project)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 4 Fluorometer</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; Assay Tubes</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding Kit 24 and 96 V14&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.96</td><td></td></tr><tr><td>Set of micropipettes that dispense between 1 &ndash; 10 &mu;L (P10), 2 &ndash; 20 &mu;L (P20), 20 &ndash; 200 &mu;L (P200) and 200 &ndash; 1000 &mu;L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Le micropipette devono essere calibrate</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Sterilized tips for 10 &mu;L, 200 &mu;L and 1000 &mu;L&nbsp;</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000 Touch&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221052</td><td>Può essere sostituito da un altro marchio</td></tr></tbody></table>

sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore

Long-Read Plasmid Sequencing and Assembly Using Nanopore Sequencing-Based Workflows

Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore

The present study describes a workflow for nanopore sequencing designed to maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy. Researchers cover each step ...

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NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l'identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopore è dimostrata.

Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo

Lungo-ha letto sequenze notevolmente facilitano l'assemblaggio di complessi genomi e caratterizzazione di variazione strutturale. Descriviamo un metodo per generare sequenze ultra-lunghi di piattaforme nanopore di sequenziamento. L'approccio adotta un'estrazione di DNA ottimizzata seguita da preparazioni di libreria modificata per generare centinaia di kilobase letture con moderata copertura da cellule umane.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Il sequenziamento di nanopore è una nuova tecnologia che consente un sequenziamento conveniente in posizioni remote e impostazioni di scarsa risorse. Qui, presentiamo un protocollo per il sequenziamento di mRNA da sangue intero che è compatibile con tali condizioni.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

In precedenza abbiamo convalidato un protocollo per il sequenziamento del virus USsutu intero genoma basato sull'amplicon (USUV) su una piattaforma di sequenziamento nanoporo. Qui, descriviamo i metodi utilizzati in modo più dettagliato e determiniamo il tasso di errore della cella di flusso nanopora R10.

Convalida del sequenziamento dei nanopore dell'intero genoma, usando Usutu Virus come esempio

Questo protocollo descrive un approccio completo per la coltura, il sequenziamento e l'assemblaggio del genoma ibrido de novo dei batteri urinari. Fornisce una procedura riproducibile per la generazione di sequenze genomiche circolari complete utili nello studio di elementi genetici sia cromosomici che extracromosomiali che contribuiscono alla colonizzazione urinaria, alla patogenesi e alla diffusione della resistenza antimicrobica.

Assemblaggio di genoma ibrido De Novo per la generazione di genomi completi di batteri urinari utilizzando tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga

Qui, presentiamo un flusso di lavoro rapido ed economico per la caratterizzazione dei genomi del virus della rabbia (RABV) utilizzando la tecnologia dei nanopori. Il flusso di lavoro ha lo scopo di supportare la sorveglianza basata sulla genomica a livello locale, fornendo informazioni sui lignaggi RABV circolanti e sul loro posizionamento all'interno delle filogenesi regionali per guidare le misure di controllo della rabbia.

Sequenziamento dell'intero genoma per una rapida caratterizzazione del virus della rabbia utilizzando la tecnologia Nanopore

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che va dalle colture cellulari ex vivo o in vitro alla pre-elaborazione dei dati trascrittomici per uno screening farmacologico basato sul trascrittoma economicamente vantaggioso.

Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi

L'assemblaggio in vivo è un metodo di clonazione indipendente dalla legatura che si basa su enzimi intrinseci di riparazione del DNA nei batteri per assemblare frammenti di DNA mediante ricombinazione omologa. Questo protocollo è efficiente in termini di tempo e costi, poiché sono necessari pochi reagenti e l'efficienza di clonazione può raggiungere il 99%.

Utilizzo dell'assemblaggio in vivo per la costruzione di plasmidi ad alta efficienza

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento profondo mirato di 18 regioni di resistenza ai farmaci in Mycobacterium tuberculosis utilizzando una piattaforma di sequenziamento a lettura lunga, seguita dall'analisi con una pipeline bioinformatica specifica per la tubercolosi progettata per dati a lettura lunga.

Sequenziamento degli ampliconi con le tecnologie di sequenziamento a lettura lunga

sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un'unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Scopri il sequenziamento e l'assemblaggio di plasmidi a lunga lettura con flussi di lavoro nanopore per biologia molecolare. Questo metodo ottimizza la resa del DNA plasmidico e la precisione del sequenziamento utilizzando Escherichia coli.

Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore

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