Lattilazione della lisina specifica per sito tramite espansione del codice genetico in E. coli e nelle cellule di mammiferi

Abbiamo sviluppato un sistema clock/RS tRNA per superare mimetismo e limitazioni enzimatiche, consentendo un'incorporazione precisa della lattilazione della lisina per studiarne biologicamente questo protocollo può essere applicato allo studio del metabolismo tumorale, delle funzioni enzimache e dei siti dell'orologio. Per cominciare, co-trasformare 50 microlitri di cellule chimicamente competenti di Escherichia coli DH10B con circa 100 nanogrammi ciascuno dei plasmidi desiderati. Incubare la miscela di trasformazione sul ghiaccio per 25 minuti, poi infliggerla uno shock termico a 42 gradi Celsius per 45 secondi.

Riporta il tubo sul ghiaccio per tre minuti. Aggiungi 350 microlitri di medium Luria bertani e scuoti vigorosamente il tubo a 220 giri al minuto per un'ora a 37 gradi Celsius. Ora diffondi la coltura cellulare trasformata su una piastra agar di Luria bertani integrata con ampicillina e cloranfenicolo.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Poi prendi una singola colonia dal piatto per inoculare una coltura starter da quattro millilitri e incubarla durante la notte. Il giorno successivo, espandi la coltura notturna in 400 millilitri di mezzo Luria bertani contenente ampicillina e cloranfenicolo.

Agitare vigorosamente la coltura a 220 giri al minuto e 37 gradi Celsius finché la densità ottica a 600 nanometri raggiunge tra 0,6 e 0,8. Successivamente indurre la coltura con 0,2%L-Arabinosio e un millimolare lattilicillisa e incubare a 30 gradi Celsius e 220 rivoluzioni al minuto per 16 ore. Le cellule seme si trovano su una piastra a 12 pozzi con una densità di uno per 10 alla potenza di cinque celle per pozzo, utilizzando un millilitro di DMEM.

Incubare per 24 ore finché la confluenza cellulare raggiunge tra il 70 e l'80%, poi procedere con la trasfezione. Per preparare la soluzione di DNA diluita, aggiungere 0,75 microgrammi di plasmide contenente sfGFP reporter e pNeu-KlacRS in un rapporto uno a uno in 38 microlitri di DMEM siero con alto livello di glucosio. Pipetta delicatamente su e giù o vortice brevemente per mescolare.

Per preparare il reagente di trasfezione diluito, aggiungere 2,25 microlitri di reagente di trasfezione in 38 microlitri di DMEM senza siero con alto livello di glucosio. Fai una pipetta delicata su e giù tre o quattro volte per mescolare bene. Aggiungi immediatamente il reagente di trasfezione diluito alla soluzione di DNA diluita tutto in una volta.

Ora pipetta su e giù tre o quattro volte per mescolare il contenuto e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10-15 minuti, permettendo la formazione dei complessi di trasfezione e DNA. Aggiungi 50 microlitri del complesso di trasfezione e DNA goccia a goccia sul mezzo in ogni pozzo e fai ruotare delicatamente la piastra per omogeneizzare la miscela. Sei ore dopo la trasfezione, sostituire il substrato con DMEM fresco contenente un millimolare lattiliclisina e coltivare le cellule per 24-48 ore.

In Escherichia coli, l'hENO1-89Klac a lunghezza intera è stato prodotto quando un millimolare lattiliclica è stato aggiunto al mezzo di crescita. L'immunoblotting ha confermato la presenza di hENO1-89Klac a lunghezza intera utilizzando anticorpi anti-etich-His e anti-L-lattilic-lisina. La spettrometria di massa del tempo di ionizzazione elettrospray ha rivelato un picco dominante a 48.178 Dalton, corrispondente alla massa attesa di hENO1-89Klac priva della metionina iniziale.

La spettrometria di massa tandem della digestione del triptico ha confermato l'incorporazione site-specific di Klac al Residuo 89 attraverso la presenza di una serie completa di ioni B&Y mappata al peptide modificato. Nelle cellule HEK293T mammiferi, la microscopia a fluorescenza ha mostrato una forte espressione di sfGFP in tutte le cellule quando Klac è stato aggiunto per 24 ore e 48 ore, mentre nessuna fluorescenza è stata osservata senza integrazione di Klac. La citometria a flusso ha rivelato che circa il 31% delle cellule ha espresso sfGFP dopo 24 ore, aumentando a circa il 37% dopo 48 ore di integrazione di Klac.

Questo protocollo consente di indagare gli effetti della lattilazione della lisina specifica sul funzionamento delle proteine e facilita la misurazione degli esiti biologici e funzionali risultanti. Seguendo questa procedura, i ricercatori possono condurre studi meccanicistici, saggi di screening ad alta produttività e generare linee cellulari stabili per un'analisi funzionale estesa. I nostri studi futuri mirano a migliorare l'efficienza, consentire un'integrazione stabile e sviluppare la biosintesi degli orologi.