Modello di ratto canulato con dotto linfatico cervicale per la valutazione del trasporto linfatico dalla testa e dal cervello

Il nostro progetto esamina come i linfonici cerebrali si relazionano alle malattie del SNC, come l'Alzheimer, l'ictus e la neuroinfiammazione, identificando sostanze che drenano dal cervello. I metodi esistenti mancavano di un protocollo e di un approccio affidabile per campionare e quantificare teoricamente il flusso linfatico derivato dal SNC, come è reso possibile da questo protocollo. Per cominciare, precarica circa 0,7 millilitri di soluzione anticoagulante diluita in una siringa sterile di insulina da un millilitro con un ago calibro 30 per rivestire la superficie interna della cannula in polietilene.

Conserva la siringa precaricata in condizioni sterili fino all'uso. Per preparare le canule, si utilizzano tubi con diametro esterno di 0,5 millimetri e diametro interno di 0,3 millimetri per entrambe le sezioni terminali e tubi di diametro esterno di 0,6 millimetri e interni di 0,5 millimetri per la sezione centrale. Con forbici, taglia i segmenti della cannula a lunghezze di due centimetri per la porzione prossimale che si collega all'ago della siringa, 40 centimetri per la parte centrale e otto centimetri per la parte distale destinata alla canulazione.

Assemblare la cannula in configurazione testa a coda. Successivamente taglia e bisella l'estremità distale dell'assemblaggio della cannula con un angolo di circa 45 gradi per facilitare un inserimento fluido nel dotto linfatico cervicale. Verifica la permeabilità di ciascuna cannula collegando la siringa precaricata all'estremità prossimale della cannula assemblata.

Rilascia delicatamente un piccolo volume di soluzione per sciacquare la cannula. Assicurati che la soluzione esca in modo fluido dall'estremità distale senza segni di perdite. Posizionare un ratto anestetizzato supino su un assorbente chirurgico riscaldato mantenuto a 37 gradi Celsius.

Inclina la testa ed estendi il collo usando un piccolo cuscino di supporto, se necessario, per aumentare l'esposizione della regione cervicale. Ibriga delicatamente gli arti anteriori usando elastici o nastri chirurgici per minimizzare i movimenti. Risciacquare il pelo della regione cervicale con soluzione salina normale sterile per facilitare la rasatura.

Poi radere accuratamente l'intero sito chirurgico per garantire la completa rimozione del pelo prima dell'incisione. Segna il sito chirurgico tracciando una linea tratteggiata di 2,5 centimetri per confermare la lunghezza dell'incisione iniziale. Posizionare l'estremità superiore dell'incisione circa da uno a 1,5 centimetri sotto il labbro inferiore.

Dopo aver confermato la profondità anestetica tramite riflesso di pizzicamento del dito dei piedi, incidere con attenzione lo strato superficiale della muscolatura cervicale lungo la linea segnata. Poi si separano delicatamente gli strati muscolari rimanenti, principalmente la fascia cervicale superficiale, per esporre l'arteria cervicale. Ritrai il muscolo sternomastoideo e la ghiandola submandibolare e inclinali lontano dal campo chirurgico per facilitare l'identificazione del dotto linfatico cervicale.

Usa un espansore tissutale per mantenere la finestra chirurgica. Con un cotton fioc, tieni temporaneamente da parte il tessuto muscolare mentre individui il linfonodo e il dotto linfático associato. Individuare il dotto linfatico opaco e incolore che corre parallelo all'arteria carotide.

Usando una pinza contundente, passa delicatamente attraverso i tessuti connettivi separati e mantiene le pinze in posizione. Isolare con cura il dotto linfatico cervicale dai tessuti connettivi e adiposi circostanti tramite dissezione contundente. Poi crea una piccola incisione nella metà superiore del vaso esposto.

Una piccola puntura secondaria cutanea a circa 1,5 centimetri dalla finestra chirurgica può essere creata come punto di fissazione aggiuntivo per la canula. Inserire la cannula attraverso la seconda apertura, afferrare l'estremità distale con la pinza e assicurarsi che la faccia smussata sia rivolta verso l'alto. Successivamente, inserire delicatamente l'estremità distale di circa due millimetri nel dotto linfatico attraverso l'incisione, orientandola verso la testa.

Monitorare l'estremità prossimale della cannula per uno o due minuti. Conferma la cannulazione efficace osservando un flusso lento e costante di liquido linfatico. Fissare la cannula applicando una piccola goccia di adesivo tissutale cianoacrilato con una pipetta nel sito dell'incisione e nel foro di fissazione secondario.

Osserva il flusso linfatico per diversi minuti per confermare un flusso costante. Poi rimuovi con cura l'espansore tissutale e riposiziona la ghiandola submandibolare nella sua posizione originale. Attaccare un tubo microcentrifuga pre-marcato, rivestito di anticoagulante, all'estremità distale della cannula.

Poi riposiziona tutti gli strati muscolari nelle loro posizioni originali e chiudi l'incisione cutanea con punti di sutura e/o adesivo tissutale. Raccogliere linfa continuamente in tubi microcentrifughe rivestiti di anticoagulanti, sostituendo i tubi a intervalli predeterminati, tipicamente ogni ora. Assicurati che il ratto rimanga anestetizzato per tutto il periodo di raccolta.

Conserva i campioni raccolti con impacchi di ghiaccio in una cella frigorifera. I flussi linfatici orari misurati durante un periodo di raccolta di sei ore nei ratti con canulazione con successo variavano da 0,09 a 0,13 millilitri all'ora. Nei ratti sani, il trasporto linfotico cumulativo dell'albumina marcata con trizio somministrata intrastriatamente è rimasto trascurabile durante le prime due ore ed è aumentato sostanzialmente successivamente.

Il confronto delle concentrazioni di albumina marcate con trizio tra linfa e plasma ha mostrato profili di concentrazione diversi nel tempo nei ratti sani. La neuroinfiammazione indotta dalla somministrazione interperitoneale di Escherichia coli lipopolisaccaride è stata associata a una leggermente ridotta velocità linfatica complessiva in otto ore e a una riduzione quasi doppia della proporzione totale della dose trasportata nella linfa. Il rapporto tra concentrazione linfa-plasma non ha mostrato differenze significative tra ratti sani e neuroinfiammati, indicando profili di clearance linfatica cervicale simili.

Questo protocollo ha permesso il campionamento biologico diretto della linfa derivata dal cervello, collegando l'imaging esterno indiretto o il metodo resinoso con il flusso misurabile del sistema nervoso centrale. Il protocollo consente di studiare la rimozione dei farmaci somministrata centralmente attraverso le vie linfattiche, consentendo la misurazione delle vie di drenaggio e dei tassi di eliminazione. Studi futuri possono esaminare come gli stati di malattia del SNC allertano di una clearance linfatica e utilizzare queste conoscenze per ottimizzare i farmaci al fine di ripristinare la funzione linfatica cerebrale per il trattamento.