Mappatura dell'immunità infantile con input minimo: profilazione integrativa a cellula singola e multiomica

La nostra ricerca definisce come l'immunità della prima età si adatta dopo la nascita utilizzando profilazione multiomica longitudinale ad alta dimensione da piccoli volumi sanguigni. Questo protocollo può essere applicato a studi neonatali e pediatrici per il profiling immunitario longitudinale da biocampioni limitati in ambito di salute, infezione e infiammazione. Per cominciare, scongela rapidamente una fiala contenente globuli rossi lizzati di neonati in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Trasferire le celle scongelate in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo RPMI caldo e completo a 37 gradi Celsius. Centrifuga il tubo a 400 g per cinque minuti a temperatura ambiente e scarta il soprantantante. Risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di mezzo RPMI completo e contare il numero totale di cellule.

Diluire il campione se la concentrazione è troppo alta per essere contata. Dopo aver contato le cellule, ripeti il passaggio di centrifugazione e risospezioni le celle in un mezzo RPMI completo per ottenere una concentrazione di un milione di celle per millilitro. Trasferire 100 microlitri contenenti 0,1 milioni di celle in ciascun pozzo di una piastra a fondo a V da 96 pozzi.

Centrifuga la piastra a 764 g per due minuti a quattro gradi Celsius. Scartate il soprannatante. Successivamente, aggiungi 100 microlitri di colorante vivo diluito da uno a 2.000 in PBS con blocco FC e blocco monocitote diluiti da uno a 100 a tutti i campioni tranne il controllo non colorato.

Incubare i campioni per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Per lavare le cellule, aggiungi 100 microlitri di PBS. Centrifugare la piastra a 764 g per due minuti a quattro gradi Celsius, e scartare con cura il soprantantante.

Aggiungere 100 microlitri di cocktail di anticorpi superficiali, diluiti da uno a 200 in modulo di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, o FACS buffer, a tutti i campioni tranne il controllo non colorato. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Poi lava le celle con 100 microlitri di tampone FACS, centrifuga e scarta il soprantantante.

Fissa le cellule aggiungendo 100 microlitri di paraformaldeide al 4% a ciascun campione. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, poi lavare nuovamente le cellule e risospendere in 200 microlitri di tampone FACS. Prepara le perle di compensazione UltraComp come controlli monocolore.

Tingere le sfere di controllo monocolore utilizzando la stessa procedura dei campioni, inclusa la fissazione se i campioni erano fissi. Inoltre, prepara la fluorescenza senza uno o controlli FMO allo stesso modo. Esegui i campioni, i controlli a colore singolo, i controlli non colorati e i controlli fluorescenti meno uno su un citometro a flusso convenzionale o spettrale.

Apri FlowJo e seleziona il campione di interesse da analizzare. Imposta le porte usando i controlli appropriati di isotipo e FMO. Utilizzare i leucociti a gate usando FSC rispetto a SSC per escludere i detriti e selezionare le cellule in base alla dimensione e granularità.

Escludere i doppietti usando FSCA rispetto a FSCH. Porta le cellule vive usando un colorante di vitalità per escludere le cellule morte. Dalle singole cellule vive, si dividono in linfociti CD33-negativi e cellule mieloidi CD-33-positive.

All'interno delle cellule CD33-positive, identificare i monociti CD14-positivi. Poi, all'interno delle cellule CD33-positive, si identificano le cellule dendritiche CD14-negative e CD11C-positive. Ora, tra i linfociti CD33-negativi camminano le cellule T CD3-positive e le cellule natural killer CD3-negative CD56-positive.

All'interno delle cellule T CD3-positive, si identificano i sottoinsiemi CD8-positivi e CD4-positivi e si identificano le cellule B CD3-negative, CD56-negative e CD19-positive. Per cominciare, scongelare una fiala di cellule lisate con globuli rossi crioconservate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo a cellule T e centrifugare a 430 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Scartate il soprannatante. Dopo aver risospeso il pellet cellulare con un millilitro di PBS, aggiungere altri nove millilitri di PBS al campione. Centrifugare il tubo a 430 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprantantante.

Contare le cellule e valutare la vitalità usando l'esclusione del blu di tripano. Se la vitalità è inferiore al 70%, procedi con l'uso di un kit di rimozione delle cellule morte come segue. Per prima cosa, prepara un tampone di legame 1x diluendo la soluzione di tampone con legame 20x con acqua sterile doppiamente distillata.

Risospendere la pellet cellulare in 100 microlitri di microperle di rimozione delle cellule morte ogni 10 fino alla potenza totale di sette cellule. Mescola bene e incuba per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la colonna di separazione magnetica nel supporto magnetico appropriato, insieme a un tubo di raccolta.

Poi bilancia la colonna risciacquando con 500 microlitri di tampone 1x-bonding. Porta il volume di sospensione della cella a 500 microlitri con un buffer di legame 1x. Dopo aver sostituito il tubo di raccolta, applicare la sospensione a celle sulla colonna e raccogliere il flusso attraverso il nuovo tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri.

Successivamente, lava la colonna due volte con 500 microlitri di tampone di legame e raccogli il flusso attraverso nello stesso tubo della microcentrifuga. Centrifuga l'eluato a 300 g per 10 minuti e scarta il soprantantante. Contare le cellule e valutare nuovamente la fattibilità usando l'esclusione del blu di tripano.

Aliquota 20.000 cellule vitali in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Poi centrifughi le celle a 300 g per 10 minuti e rimuovi il soprantantante. Risospendere le celle con 40 microlitri di PBS contenenti lo 0,04% di BSA.

Infine, posizionare il tubo contenente le cellule sul ghiaccio e inviarlo immediatamente a una struttura genomica per la generazione e il sequenziamento delle librerie. Raccogli i risultati del sequenziamento nel formato degli output del cell ranger. Sono stati processati campioni di sangue secco da neonati prematuri e controlli.

E l'espressione proteica normalizzata di 92 proteine immunocorrelate è stata quantificata. L'espressione del gene tre per attivazione dei linfociti e dell'adattatore transmembrana regolatore della soglia di segnalazione 1 è stata significativamente più alta nel sangue periferico di neonati pretermine a due mesi di età rispetto al sangue a termine del cordone. È stata utilizzata una strategia completa di gating per identificare le popolazioni di leucociti da campioni di globuli bianchi lisati da globuli rossi.

All'interno della popolazione di cellule T, sono stati distinti sottoinsiemi positivi a CD4 e positivo a CD8. Dopo il filtraggio, oltre 120.000 cellule sono state catturate e profilate nel dataset di sequenziamento degli acidi ribonucleici a singola cellula. La riduzione della dimensionalità e l'analisi del clustering hanno identificato 14 cluster cellulari distinti.

I cluster cellulari sono stati annotati in base a geni espressi differenzialmente e marcatori cellulari noti. 12 dei 14 cluster corrispondevano a linee cellulari immunitarie, inclusi cellule T, cellule natural killer, cellule B, mieloidi e neutrofili. Un grafico a barre sovrapposte ha illustrato la proporzione relativa di cellule per cluster su una settimana, un mese e due mesi di età.

Questo studio consente la misurazione longitudinale di firme immunitarie cellulari, trascrittomiche, proteomiche e funzionali da campioni di sangue a volume limitato. Studi futuri possono utilizzare questi metodi per definire traiettorie immunitarie sane e scoprire risposte immunitarie precoce disregolate legate a malattie.