Un modello di lesione da ipossia-reossigenazione in cardioidi umani autoassemblanti

La nostra ricerca si concentra sulla ricerca di nuovi modi per aiutare il cuore a rigenerarsi dopo un infortunio. Per questo generiamo organoidi cardiaci autoassemblanti e eseguiamo studi sulla ipossia-riossigenazione. Questo protocollo può essere applicato per studiare la risposta alle lesioni, interventi terapeutici per promuovere la rigenerazione e può essere utilizzato per la modellazione specifica della malattia per paziente.

Per cominciare, aspirare il mezzo di specificazione del mesoderma cardiaco D1 e aggiungere una soluzione sufficiente per il distacco cellulare da coprire completamente le cellule cardiache cardiache derivate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Poi metti il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando una pipetta, aggiungi un volume uguale di mezzo mesodermico cardiaco D2 in ciascun pozzo e pipetta delicatamente su e giù per liberare le cellule aderenti, trasferisci la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri.

Usando una centrifuga, pelleta le celle a 300G per tre minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di specificazione del mesoderma cardiaco D2 contenente cinque micromolari IWP-2 e 50 microgrammi per millilitro di acido ascorbico in RB minus. Mescola 10 microlitri di trippan blu con 10 microlitri di sospensione cellulare in un microtubo.

Contare le cellule utilizzando il metodo di conteggio preferito, poi diluirle a una concentrazione di 100.000 cellule per millilitro in mezzi di specificazione del mesoderma cardiaco D2 integrati con due micromolari tiazovivina. Trasferire la sospensione della cella in un serbatoio di reagenti di dimensioni adeguate. Poi, utilizzando una pipetta multicanale, si distribuiscono 100 microlitri in ciascun pozzo di una piastra di 96 pozzi a attacco ultra-basso per ottenere una concentrazione finale di 10.000 celle per pozzo.

Fai ruotare la piastra a 500G per cinque minuti a temperatura ambiente per indurre la formazione di organoidi cardiaci umani in coltura in sospensione. Osserva la formazione di un grande pellet cellulare ben circonscrito in ciascun pozzo. Se la pellet non è circoscritta, ripetere la centrifugazione.

Dopo 24 ore, preparare 10 millilitri di mezzo D3 contenenti cinque micromolari IWP-2 e 50 microgrammi per millilitro di acido ascorbico in RB meno per piastra di piatta. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungi 100 microlitri di mezzo D3 a ogni pozzo senza rimuovere alcun mezzo esistente. Il giorno successivo, rimuovere 100 microlitri di materiale D3 da ogni pozzo.

Per minimizzare il rischio di aspirazione, inclinare la piastra a un angolo di 45 gradi e tenere una pipetta multicanale a un angolo di 90 gradi rispetto alla parete laterale della piastra (last). Posiziona la pipetta saldamente sulla parete del pozzo e aspira lentamente. Dopo aver rimosso il substrato, sostituiscilo con 100 microlitri di substrato D4 contenenti cinque micromolari IWP-2 in RB minus.

Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri con la punta tagliata, trasferisci gli organoidi cardiaci umani in un tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Lascia che gli organoidi sprofondino sul fondo del tubo e rimuovi delicatamente il substrato in eccesso. Aggiungi soluzione salina tamponata con fosfato per lavare gli organoidi una volta.

Aspetta qualche secondo che affondino e rimuovi delicatamente l'eccesso di PBS. Successivamente, aggiungi il 4% di paraformaldeide per fissare gli organoidi e posiziona il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la fissazione. Successivamente trasferisci il numero desiderato di organoidi fissi su un tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri.

Rimuovere la soluzione fissativa e lavare gli organoidi con PBS contenente 0,1% Tween 20. Preparare la soluzione primaria di anticorpi diluendo l'anticorpo alla concentrazione desiderata nella soluzione di colorazione. Utilizzando una pipetta, aggiungi da 50 a 100 microlitri della soluzione primaria di anticorpi a ciascun tubo della microcentrifuga, assicurandosi che gli organoidi siano completamente coperti.

Dopo l'incubazione e i lavaggi successivi, incubare il campione con anticorpo secondario diluito in soluzione di colorazione per 24 ore a quattro gradi Celsius su una piattaforma di scuotimento. Dopo l'incubazione, esegui i lavaggi come descritto in precedenza. Successivamente, utilizzando una punta di pipetta tagliata, trasferisci gli organoidi su un vetrino di vetro caricato positivamente.

Rimuovere delicatamente l'eccesso di PBS con Tween 20 e aggiungere qualche goccia di materiale di montaggio per coprire gli organoidi. Posiziona con cura una copertura sugli organoidi per appiattirli. Poi procedi con la microscopia a fluorescenza.

Dopo aver incubato gli organoidi fissi durante la notte in saccarosio al 30% a quattro gradi Celsius, trasferili in uno stampo di plastica e aggiungi una piccola goccia di composto a temperatura di taglio ottimale allo stampo, giusto il necessario per coprire gli organoidi. Usando pinzette fini o punta di pipetta, riposiziona delicatamente gli organoidi nel composto in modo che non si agglutino e siano lontani dai bordi dello stampo. Posizionare gli organoidi il più vicino possibile al fondo dello stampo per massimizzare il numero presente in una singola criosezione.

Inserisci lo stampo in un raffreddatore di polistirolo contenente uno strato di ghiaccio secco per congelare lo strato iniziale di composto a temperatura di taglio ottimale. Aspetta qualche minuto che il composto si indurisca e poi sposta lo stampo sul piano di lavoro. Aggiungi un composto aggiuntivo a temperatura ottimale di taglio finché lo stampo non è riempito.

Lascia sciogliere completamente il primo strato prima di rimettere lo stampo nel ghiaccio secco per congelare completamente. Una volta congelati, conservare gli stampi a meno 80 gradi Celsius oppure procedere con la criosezionamento per ottenere sezioni da sei micrometri. Utilizzando una pipetta, trasferire cinque millilitri di mezzo ipossico per ogni piastra organoide cardiaca umana a 96 pozzi in una fiaschetta di coltura cellulare.

Inserisci la fiaschetta all'interno di una camera per ipossia e risciacqua la camera con gas anosico composto dal 5% di anidride carbonica e 95% di azoto per tre minuti. Posiziona la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima di iniziare l'ipossia. Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere circa 150 microlitri di mezzo da tutti i pozzi della piastra organoide cardiaca umana.

Poi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovi con cura il materiale residuo da ogni singolo pozzo senza disturbare gli organoidi. Aggiungi 50 microlitri di mezzo per ipossia in ciascun pozzo. Inserire la placca organoide cardiaca umana nella camera dell'ipossia.

E risciacquare la camera con gas ossico composto dal 5% di anidride carbonica e 95% di azoto per tre minuti. Posiziona la camera dell'ipossia in un incubatore a 37 gradi Celsius per sei ore. Per avviare la reossigenazione, rimuovere gli organoidi cardiaci umani dalla camera dell'ipossia.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungi 150 microlitri di RB+media preriscaldata in ciascun pozzo. Infine, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e lasciare almeno tre ore di riossigenazione prima di eseguire i test a valle. Dopo sei ore di ipossia e 24 ore di reperfusione, l'attività extracellulare del lattato deidrogenasi è aumentata significativamente negli organoidi cardiaci umani lesionati rispetto ai controlli non lesionati.

Gli organoidi cardiaci trattati con ipossia hanno mostrato nuclei cardiomiociti positivi a TUNEL, e la percentuale di nuclei cardiomiociti positivi a TUNEL era significativamente più alta negli organoidi lesionati rispetto ai controlli non lesionati. È stato osservato un aumento dipendente dal tempo nella formazione delle cicatrici con l'aumento della durata dell'ipossia prima della riossigenazione. A 24 ore dalla reperfusione, il 69% degli organoidi cardiaci umani non lesionati batteva, mentre nessuno degli organoidi lesi batteva.

Gli organoidi cardiaci umani non danneggiati hanno mostrato transitori di calcio sincronizzati in cinque regioni di interesse, con picchi che si verificano contemporaneamente e con forme d'onda simili. Gli organoidi cardiaci umani lesionati non hanno mostrato contrazioni coordinate ma invece hanno mostrato transitori di calcio spontanei irregolari nelle regioni di interesse. Questo protocollo consente ai ricercatori di imitare l'infarto miocardico in organoidi cardiaci umani derivati da iPSC.

La più grande sfida tecnica per garantire danni riproducibili è la completa rimozione dei supporti esistenti. I nostri studi futuri mirano a identificare fattori che possono promuovere la rigenerazione tissutale nei modelli organoidi cardiaci umani.