Campionamento del DNA ambientale da navi per l'osservazione delle balene per il monitoraggio dei cetacei

Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato al campionamento di eDNA delle balene durante le crociere di osservazione delle balene. Sono disponibili molti metodi diversi per il campionamento di eDNA. Questo ostacola l'analisi comparativa dei dati.

Il nostro protocollo è stato ottimizzato in base alle condizioni ambientali e alle tutele contro la contaminazione. Con il supporto di un laboratorio radio eDNA, questo protocollo può essere eseguito da non esperti e scienziati cittadini durante le attività di osservazione delle balene e in tutto il mondo. Per cominciare, prepara materiali di documentazione sul campo, inclusi i dati del campo e il protocollo laminato passo passo per il campionamento del DNA ambientale dei cetacei.

Metti un marcatore impermeabile, due filtri eDNA per ogni impronta fluke, un numero sufficiente di guanti e un contenitore dedicato ai rifiuti nella scatola. Prepara uno o più secchi rigidi adatti al tipo di imbarcazione e alla configurazione di bordo, un contenitore ambientale secondario per il DNA e una pompa d'acqua peristaltica o a vuoto portatile. Indossare i guanti durante la gestione di tutte le attrezzature e cambiare i guanti tra un compito e l'altro.

Per sterilizzare l'attrezzatura, applica una soluzione di candeggina domestica diluita spruzzando uniformemente su tutte le superfici dei secchi, dei coperchi, dei contenitori e dei tubi della pompa. Risciacqua accuratamente con acqua del rubinetto tre volte. Porta tutto il materiale a bordo prima dell'arrivo dei passeggeri e conservalo in un'area pulita designata.

Coordinare il tempismo del campionamento e il posizionamento dell'imbarcazione con l'equipaggio della nave. Osserva i modelli in superficie sull'acqua per anticipare le immersioni delle balene. Raccogli 20 litri di acqua di mare dall'impronta del fluke, assicurandoti un ritardo di non più di 10 minuti dopo le immersioni della balena.

Ottieni campioni da varie regioni utilizzando condizioni logistiche personalizzate e adatte a ciascuna località e tipo di imbarcazione. Se necessario, trasportare l'acqua raccolta a una stazione di filtrazione designata a bordo, evitando fuoriuscite. Registra l'identità della specie, le coordinate del sistema di posizionamento geografico, l'orario e l'identificazione delle repliche del campione nel datasheet.

Cambia i guanti prima della filtrazione. Apri la busta del filtro e maneggia il filtro solo vicino alla presa. Inserisci l'ingresso nello snorkel, poi collega il tubo della pompa all'uscita.

Immergi lo snorkel nel campione d'acqua senza immergere la carcassa del filtro, e imposta la pompa su una portata alta e costante. Filtra 10 litri in modo continuo monitorando la stabilità del flusso. Successivamente, inverti il filtro e fai funzionare la pompa per 30-60 secondi per rimuovere l'acqua residua.

Personalizza la configurazione della pompa di filtraggio in base alle condizioni del campo. Spegni la pompa e scollega il tubo. Metti il filtro nella busta originale e etichettalo immediatamente.

Cambia i guanti e preparati a eseguire la filtrazione per la seconda replica. Conserva i filtri ambientali a DNA autoconservanti in un contenitore sicuro e asciutto in una stanza ombreggiata a temperatura ambiente. Conserva i filtri in frigorifero se la temperatura ambiente supera i 20 gradi Celsius e spedi entro tre mesi.

Esegui tutte le procedure di laboratorio in stanze dedicate sterilizzate ai raggi ultravioletti con ventilazione adeguata. Dopo aver indossato guanti e indumenti protettivi senza DNA, pulisci accuratamente i banchi da lavoro. Utilizzando pinze senza DNA, piega la membrana filtrante in triangoli e trasferiscila in un tubo di reazione da due millilitri con la punta orientata verso il basso.

Aggiungere un buffer di lisi di 400 microlitri composto da 380 microlitri di tampone TES e 20 microlitri di proteinasi K a ciascun tubo di reazione. Vortice brevemente e incuba a 56 gradi Celsius per almeno tre ore con agitazione. Inserire il filtro in un'entrata di plastica con fondo perforato e centrifugare a 18, 626G per 10 minuti a temperatura ambiente per separare il tampone di lisi dal filtro.

Reagenti di estrazione per pipette in piastre di lavaggio e piastre di eluzione. Usa piastre di legaggio multiple se il volume totale del lisato supera i 300 microlitri. Vortice particelle magnetiche e aggiungi 30 microlitri per pozzo nella prima piastra di legaggio.

Esegui il programma preliminare di assorbimento del DNA per due piastre di legame e il successivo programma di estrazione del DNA sul robot. Per eseguire tutte le reazioni QPCR in triplice, prepara il master mix richiesto in uno spazio di lavoro dedicato e distribuiscilo tra i pozzi. Aggiungi tre microlitri di estratto standard di DNA bersaglio o eDNA a ciascun pozzo.

Dopo aver sigillato la piastra PCR preparata, centrifugarla a 3.500G per 10 secondi e inserire la piastra nel termociclatore quantitativo in tempo reale. Infine, esegui il test in condizioni di ciclismo ottimizzate. Sono stati raccolti 247 campioni ambientali di DNA o eDNA nella baia di Skjalbandi, Islanda, e nelle Azzorre, con la raccolta di fino a 10 litri di acqua di mare con due filtri eDNA autoconservanti per ogni impronta di fluke.

Tra i 44 filtri eDNA analizzati per l'eDNA della megattera, 20 hanno prodotto segnali di amplificazione, mentre 24 non hanno mostrato amplificazione. I blank di estrazione, i controlli di campo e i controlli quantitativi PCR non hanno mostrato un'amplificazione rilevabile, indicando l'assenza di contaminazione. Tra le reazioni positive, nove filtri eDNA hanno prodotto almeno un valore di soglia del ciclo sotto il limite di rilevamento e sono stati classificati come rilevamenti affidabili.

I restanti 11 filtri EDNA produssero valori di soglia ciclistica superiori al limite di rilevamento che indicano rilevamenti plausibili. Il valore medio del ciclo di soglia era leggermente inferiore nei filtri eDNA delle Azzorre, circa 34,7, rispetto ai filtri islandesi con un valore di circa 36,9. La differenza nei valori di soglia del ciclo tra i filtri eDNA delle Azzorre e Islanda non è stata statisticamente significativa.

Questo protocollo può essere utilizzato per future campagne di campionamento su larga scala di eDNA per indagare la biodiversità marina o la genetica delle popolazioni di balene. Questo protocollo consente la rilevazione e il monitoraggio non invasivo di taxa di cetacei e coessi tramite eDNA contenuto nelle impronte di flukee raccolte da navi per l'osservazione delle balene.