Name: Test di citometria multiplex basata su perle per profilazione funzionale delle cellule T CAR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri il test di citometria multiplex basata su perle per la profilazione funzionale delle cellule T CAR umane. Questo metodo consente la rilevazione simultanea di citochine e mediatori citotossici da campioni limitati.

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<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Assaggio multiplo di citochine basato su perline per citometria a flusso</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Strumento basato sul web per il gating e l'analisi automatizzati dei dati MACSPlex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Strumento di citometria a flusso per la misurazione dei dati multiplo</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Strumento di citometria a flusso per la misurazione dei dati multiplo</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Software per il gating e l'analisi automatizzati</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Medium per coltura cellulare privo di siero ottimizzato sviluppato per la coltivazione e l'espansione di cellule T umane e murine</td></tr></tbody></table>

test di citometria multiplex basata su perle per profilazione funzionale delle cellule t car

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Test di citometria multiplex basata su perle per profilazione funzionale delle cellule T CAR

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione funzionale dei linfociti T con recettore chimerico (CAR T) e ha sviluppato un saggio multiplex compatibile con la citometria a flusso per l'analisi della secrezione di molecole effettrici. Questa procedura può essere applicata alla ricerca sui CAR T per la caratterizzazione funzionale, indagini meccanicistiche, test di controllo qualità e valutazione dell'efficacia.Per iniziare, preparare colture cellulari di linfociti T umani ingegnerizzati con recettore chimerico dell'antigene, o cellule T CAR, insieme a cellule bersaglio che esprimono o meno l'antigene corrispondente, in un rapporto effettore:bersaglio di 2,5 a 1. Definire uno o più punti temporali per il prelievo del sopranatante, al fine di analizzare le citochine secrete o monitorare la cinetica delle citochine in un arco di tempo definito.Ricostituire lo standard dell'analita aggiungendo 200 microlitri di tampone o di mezzo di coltura cellulare al pellet e mescolare delicatamente. Preparare sei provette con i reagenti ed effettuare una serie di diluizioni da uno a cinque dello standard ricostituito fino a 3,2 picogrammi per millilitro o 0,6 picogrammi per millilitro. Preparare un campione bianco. A ore definite dopo la co-coltura, centrifugare la co-coltura a 300 g per cinque minuti a 21 gradi Celsius. Utilizzare i soprannatanti direttamente oppure diluirli per rientrare nel range della curva standard.Inumidire in anticipo una piastra filtrante MACSPlex con 200 microlitri di tampone MACSPlex per pozzetto, quindi utilizzare un manifold a vuoto o una centrifuga per aspirare fino a quando i pozzetti non si saranno svuotati. Vortexare la miscela di perle di cattura per ri-sospendere completamente le perle. Aggiungere 50 microlitri di standard o campione e 20 microlitri di perle pre-diluite nei pozzetti di una piastra filtrante a 96 pozzetti. Incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente con agitazione a 450 rpm al buio. Lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di tampone utilizzando un manifold a vuoto. Aggiungere 100 microlitri di reagente di rilevamento 1 pre-diluito 1 a 50 nei pozzetti. Incubare per un'ora a temperatura ambiente con agitazione a 450 rpm, al buio. Lavare nuovamente i pozzetti due volte. Aggiungere 100 microlitri di reagente di rilevamento 2 pre-diluito 1 a 50 nei pozzetti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione a 450 rpm al buio. Lavare i pozzetti una volta e ri-sospendere i campioni in 200 microlitri di tampone.Utilizzare il codice a barre 2D sul flacone delle perle di cattura per caricare le impostazioni di acquisizione nel citometro a flusso MACSQuant. Dopo aver effettuato l'accesso al software, selezionare la piastra filtro MACSPlex come supporto per i campioni. Fare clic sul pulsante Barcode nella barra degli strumenti per attivare il lettore di codici 2D. Presentare il flacone al lettore con il codice a barre rivolto verso la luce lampeggiante, a una distanza compresa tra 0,5 e 2,5 centimetri. Nella scheda Autolabel, assegnare le perle di cattura come MPx cellule T citotossiche umane e cellule natural killer e selezionare Nolabel. Definire le posizioni dei gruppi per le diluizioni seriali del campione standard di cellule T citotossiche e cellule natural killer. Nella scheda Impostazioni, selezionare la modalità Express. Impostare il tipo su Analisi e la modalità su MACSPlex_Standard. Quindi applicare una miscelazione delicata. Assegnare il campione sconosciuto in modo analogo e definirne le posizioni. Facoltativamente, raggruppare i campioni e inserire identificatori e descrizioni dei campioni. Nella scheda Impostazioni, selezionare nuovamente la modalità Express. Impostare il tipo su Analisi e la modalità su MACSPlex_Sample. Nella tabella dell'esperimento, verificare che le definizioni del supporto siano corrette. Assicurarsi che i livelli di liquido nei pozzetti della piastra filtro siano adeguati e avviare la misurazione. Utilizzando i canali phycoerythrin o PE, fluorescein isothiocyanate o FITC e allophycocyanin o APC, acquisire i dati su un citometro a flusso dotato di laser blu e rosso. Verificare che i modelli della modalità express siano utilizzati per il gating automatico e l'analisi dei dati nel citometro a flusso MACSQuant. In alternativa, caricare file di dati FSC o MQD sullo strumento web-based InspectoR per misurazioni quantitative automatizzate delle citochine e risultati pronti per l'esportazione. Verificare un'adeguata separazione delle 12 diverse popolazioni di perle di cattura nel canale FITC rispetto a PE. Applicare la curva standard per calcolare le concentrazioni delle citochine. Infine, esportare e visualizzare i risultati.Utilizzando la codifica multiplex di perline, diversi gruppi di perline rappresentanti singoli analiti sono stati chiaramente risolti nel grafico biaxiale. Dopo la co-coltura con cellule tumorali bersaglio, le cellule CAR T hanno secreto elevate concentrazioni di granzima B, interferone gamma o INF-gamma, fattore di necrosi tumorale alfa o TNF-alfa e fattore stimolante le colonie di granulociti e macrofagi o GM-CSF, indicando un'attivazione potente e una funzione effettrice citotossica. I livelli di interleuchina-2 o IL-2 hanno superato il limite superiore di rilevamento, coerentemente con un forte segnale proliferativo. Le citochine associate a risposte di cellule T regolatorie o di tipo helper alternative, inclusi IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 e proteina chemiotattica dei monociti 1 o MCP-1, erano presenti a livelli bassi o quasi non rilevabili. Le cellule CAR T hanno mostrato un rilascio rapido e robusto di citochine in seguito al riconoscimento di bersagli positivi per l'antigene, con un forte aumento di granzima B, IFN-gamma, TNF-alfa, GM-CSF e IL-2 entro 8-24 ore, raggiungendo livelli massimi a 48 ore. Sono stati osservati anche aumenti moderati di IL-6, IL-17A, IL-21 e perforina. IL-4, IL-10 e MCP-1 sono rimaste basse o leggermente elevate. Le co-colture con bersagli negativi per l'antigene hanno mostrato una minima induzione di citochine per tutti gli analiti.Questo protocollo consente la quantificazione di citochine, chemochine e mediatori citotossici che riflettono l'attivazione dei linfociti T con recettore anticancro (CAR T) e la loro funzione effettrice. I parametri più importanti in questo protocollo sono la durata della co-coltura, il rapporto effettori-target, la diluizione del campione e il mantenimento di livelli quantificabili di analiti. Dopo aver eseguito questa procedura, il profilo del sopranatante può essere abbinato a saggi mediante citometria a flusso, fenotipizzazione dei CAR T cell o saggi di citotossicità.

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L'IP-FCM metodo viene presentato, che permette una sensibile, robusto, la valutazione biochimica di natale interazioni proteina-proteina, senza la necessità di ingegneria genetica o di campioni di grandi dimensioni.

IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

Questo video mostra un test immunologico multiplex basato su microsfere per quantificare più bersagli di citochine in un campione. Una miscela di microsfere distinte coniugate ad anticorpi specifici per le citochine viene utilizzata per legare le citochine presenti nel campione. I reporter marcati con streptavidina vengono immobilizzati sulle citochine legate utilizzando anticorpi di rilevamento biotinilati. La citometria a flusso identifica le citochine legate in base alle dimensioni uniche e...

Un test immunologico multiplex basato su microsfere per quantificare più bersagli di citochine

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Analisi del film lacrimale citochine aiuta a studiare varie malattie oculari. Saggi multiplex perlina basata sono semplici e sensibili e abilitare il testing di bersagli multipli in campioni con piccoli volumi. Qui descriviamo un protocollo per lacrima film cytokine profilatura un mediante perlina basato su analisi multiplex.

Perla base Multiplex Assay per l'analisi dei profili di Cytokine di lacrima

Questo protocollo descrive la quantificazione degli obiettivi di citochina multipli simultaneamente in surnatanti di coltura del tessuto raccolti da splenocytes stimolati del mouse utilizzando la piattaforma di base di immunoassay perlina multiplex e un citometro a flusso.

Multiplex Cytokine Profilatura degli Splenocytes stimolati Mouse utilizzando una piattaforma basata su Cytometric Bead Immunoassay

L'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro caratterizzazione mediante citometria a flusso possono contribuire in modo significativo alla comprensione del modello di risposta immunitaria contro gli impianti. Questo articolo descrive un metodo preciso per l'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro colorazione per l'analisi citofluorimetrica.

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

Questo rapporto descrive un protocollo automatizzato per saggi di immunofluorescenza multiplex (mIF) su un coloratore automatico per vetrini. Dimostra l'elevata riproducibilità della proteomica spaziale su autocoloratori tissutali standard ad alto rendimento e imager a fluorescenza su vetrini interi, ideale per saggi mIF personalizzati su un gran numero di vetrini tissutali nella ricerca traslazionale.

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un...

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