Generazione del modello murino con attivazione immunitaria materna gestazionale precoce per valutare l'infiammazione prenatale nello sviluppo neurologico

Il nostro laboratorio studia come l'infiammazione prenatale alteri la biologia della microglia, le cellule immunitarie del cervello che contribuiscono a esiti neuroevolutivi avversi. I modelli MI esistenti si concentrano sulla gestazione media. Tuttavia, presentiamo un protocollo gestazionale precoce che incorpora inoltre metriche di controllo qualità per migliorare la sopravvivenza e la coerenza.

Il modello può essere applicato a qualsiasi tipo selvatico o modello genetico di topo per esplorare l'impatto dell'infiammazione ambientale sullo sviluppo cerebrale. Per cominciare, allestire due femmine C57 BL6 da otto a dieci settimane con maschi riproduttori C57 BL6 nel tardo pomeriggio o la sera. La mattina seguente, valuta le femmine di topo per eventuali tappi vaginali e continua a controllare una volta al giorno fino a quando non avviene il tappo.

I tappi sono temporanei e potrebbero cadere entro il pomeriggio, se non vengono controllati al mattino. Dopo aver confermato il tappo vaginale, pesa la femmina del topo e registra il peso per monitorare lo stato della gravidanza monitorando l'aumento di peso durante la gestazione. Separare le femmine collegate in gabbie individuali e mantenerle in condizioni abitative standard con accesso ad libidum a cibo e acqua.

Designa le femmine con il plug come giorno embrionale 0,5 e registra la data del plug vaginale per garantire un tracciamento accurato dell'età gestazionale. Per ricostituire il policarbonato policarbonato liofilizzato in una soluzione di stock ad alta concentrazione, scioglierlo in soluzione salina sterile o in acqua sterile secondo le istruzioni del produttore. Vortex, la soluzione di stocco ad alta concentrazione.

Successivamente, diluire la soluzione in soluzione salina per preparare un materiale a bassa concentrazione. Per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, si collocano circa 125 microlitri della bassa concentrazione in tubi da 1,5 millilitri e si conservano i tubi a 20 gradi Celsius o 80 gradi Celsius. Immediatamente prima dell'iniezione, il giorno embrionale 9,5.

Diluire la base di poli IC a bassa concentrazione con soluzione salina sterile per ottenere una concentrazione funzionante. Riscaldare il materiale di lavoro a 65 gradi Celsius per 10 minuti per garantire una corretta reanealizzazione della struttura dell'acido ribonucleico a doppio filamento. Poi vortice o pipetta la soluzione per garantire una miscela omogenea prima dell'iniezione.

Per confermare la gravidanza, pesare la diga la mattina del giorno embrionale 9,5. Calcola il volume di iniezione di poli-IC per l'attivazione immunitaria materna, o MIA, e il volume di iniezione salina allo 0,9% per i controlli. Preleva il volume appropriato della soluzione di lavoro poli-IC preparata o della soluzione salina in una siringa sterile calibro 27 o più piccola.

Ora, blocca correttamente la diga per minimizzare dolore e disagio. Iniettare l'acido poli-IC o la soluzione salina intraperitoneale nel quadrante inferiore sinistro o destro appena sopra il livello dell'anca o al secondo set di capezzoli. Poi getta le siringhe in un contenitore BioSafety Sharps.

Inoltre, registra la parte iniezione per mantenere la coerenza tra le coorti. Riporta immediatamente la diga nella gabbia di casa e monitora eventuali segni di disagio. Poi integra la gabbia con idrogel per almeno 24 ore dopo l'iniezione per prevenire la disidratazione associata al comportamento di malattia.

Dopodiché, annota il volume iniettato della dose poli-IC, data e ora dell'iniezione, l'età gestazionale e il numero del lotto del poli-IC. Tre ore dopo l'iniezione, osserva ogni topo singolarmente per un minuto e valuta comportamenti come ridotta attività, postura curva, smorfie facciali o feci acquose utilizzando una scala a tre punti. Classificare i topi che mostrano uno o più di questi comportamenti come comportamenti di malattia acuta.

Poi, utilizzando un metodo minimamente invasivo come il sanguinamento della coda, raccogliere con cura il sangue materno dalla diga iniettata. Raccogli circa 50 microlitri di sangue. Dopo aver confermato l'emostasi, riportare la diga nella gabbia di casa.

Lascia coagulare il sangue raccolto per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifuga il campione a 2000 G per cinque minuti a temperatura ambiente per separare il siero dal coagulo. Dopo aver centrifugato nuovamente il campione, raccogli con cura lo strato siero superiore trasparente senza disturbare il coagulo.

Conserva il siero a 20 gradi Celsius, fino a quando non è pronto per l'analisi delle citochine a valle. Dopo l'iniezione, pesa le dighe ogni giorno per tre giorni per monitorare la risposta all'acido poli-IC. Il giorno del parto previsto, annota i risultati della cucciolata inclusi la dimensione, la vitalità del cucciolo o l'assenza per indicare una gravidanza fallita.

Rimuovere prontamente eventuali cuccioli deceduti e smaltirli secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza. Utilizzare ELISA o saghi multipli per quantificare citochine infiammatorie come IL-6 e TNF-alfa nel siero materno dopo MIA o iniezioni di controllo secondo le istruzioni del produttore. Dopo la quantificazione, si utilizzano i risultati per stabilire una soglia rappresentativa per la risposta MIA.

Infine, esegui un'analisi statistica utilizzando il nostro software per valutare la relazione tra i livelli di IL-6 nel siero materno e il TNF alfa. Dopo la somministrazione di poli IC al giorno embrionale 9,5, le dighe MIA hanno mostrato livelli di IL-6 significativamente aumentati rispetto alle dighe di controllo. I livelli di TNF alfa hanno mostrato una forte correlazione positiva con i livelli materni di IL-6.

Tra il giorno embrionale 0,5 e il giorno embrionale 9,5, le madri che hanno partorito con successo hanno preso molto più peso rispetto a quelle che non sono riuscite a produrre una cucciolata. Un giorno dopo l'iniezione, le dighe MIA hanno perso peso, mentre le dighe di controllo trattate con soluzione salina hanno preso peso. Ma al giorno 12 embrionale, entrambi i gruppi hanno mostrato un aumento di peso simile.

Il peso pre-gravidanza non ha influenzato l'efficacia della cucciolata né nelle dighe controllate trattate con soluzione salina né nelle dighe MIA. Tuttavia, i topi BL6 C57 provenienti dai Jackson Labs hanno avuto cucciolate più riuscite rispetto ai topi BL6 C57 provenienti da Charles River durante la procedura MIA. Al contrario, la fonte della poli IC non influiva sull'efficacia della cucciolata.

Inoltre, gli animali provenienti dai laboratori Jackson presentavano una risposta infiammatoria materna più robusta, misurata dal siero IL-6, rispetto agli animali provenienti da Charles River. Al contrario, la risposta infiammatoria materna è stata la stessa tra le diverse fonti di poli IC. Il protocollo consente la generazione riproducibile del modello MIA precoce e la correlazione della gravità dell'infiammazione materna con gli esiti sperimentali della prole. È fondamentale mantenere registri dettagliati, tracciare i numeri di lotto dei reagenti e valutare le risposte delle citochine materne in tutte le dighe per garantire risultati riproducibili.