Isolamento a nucleo singolo dal tessuto endorerectomico coronarico di pazienti con bypass coronarico

Il nostro principale obiettivo di ricerca è mappare la diversità cellulare nelle placche aterosclerotiche instabili per comprendere le interazioni cellula a cellula, e poi sviluppare marcatori prognostici basati su RNA. La fragilità della membrana ostacola l'isolamento di singole cellule dal tessuto ottenuto durante l'endarterectomia. Pertanto, questo protocollo prevede l'isolamento dei nuclei preservati, consentendo la profilazione trascrittomica delle placche ad alto rischio.

Per cominciare, raccogli tutti i reagenti e il frigorifero per eseguire la procedura. Lava il tessuto una o due volte con un medium RPMI senza siero per rimuovere macchie e frammenti di sangue. Usando una pinza sterile, trasferisci il tessuto su una piastra di Petri sterile e registra il peso.

Utilizzando una lama chirurgica numero 10, trita il tessuto in piccoli pezzi di circa un millimetro cubo di dimensione. Ora aggiungi un buffer di lisi raffreddato di un millilitro e il tessuto in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Taglia i piocchi sul ghiaccio usando un micro pestello applicando una forza delicata e costante e facendo roteare il micropescinello alternativamente in senso orario e antiorario.

Continuare la lisi per circa 30 minuti mantenendo il campione sul ghiaccio. Filtra la soluzione attraverso un colino di pori da 100 micrometri in un tubo centrifugo da 15 millilitri per rimuovere detriti e pezzi di tessuto. Centrifugare i nuclei a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius usando un rotore oscillante a secchio.

Poi rimuovi il surnante usando una punta normale di pipetta senza disturbare il pellet. Raffreddare i nuclei con un lavato in un tampone di risospensione su ghiaccio prima dell'uso. Risospendi il pellet nel lavaggio dei nuclei raffreddati e nel buffer di risospensione.

Valuta rapidamente l'efficienza della lisi e la vitalità cellulare aggiungendo cinque microlitri di blu di Trypan a un'aliquota del campione e contando le cellule usando un emocitometro. Se vengono osservate cellule vitali al microscopio, ripetere le fasi di lisi, filtrazione e centrifugazione. Poi filtra la soluzione attraverso un colino di poro da 30 micrometri in un tubo centrifuga da 15 millilitri per rimuovere detriti e grumi.

Centrifugare i nuclei a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius usando un rotore oscillante a secchio. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante usando una punta di pipetta a diametro normale senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in un lavaggio e buffer di risospensione di nuclei da un millilitro. Prendi 15 microlitri della sospensione dei nuclei isolati in un tubo da 1,5 millilitri per microcentrifuga.

Aggiungi cinque microlitri di colorante blu Trypan allo 0,4% di peso per volume alla sospensione dei nuclei e mescola delicatamente tramite pipetta. Dopo un'incubazione di cinque minuti, carica 10 microlitri della miscela colorata su un emocitometro. Osserva il campione al microscopio rovesciato per esaminare la morfologia e contare il numero di nuclei.

Prendi un millilitro della sospensione a nuclei isolati e centrifuga a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius usando un rotore oscillante a secchio. Rimuovi il sovrantantante usando una punta normale a canna senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un tampone cellulare di selezione attivato a fluorescenza da 200 microlitri composto da PBS e albumina sirica bovina all'1%.

Dividere i 200 microlitri dei nuclei risospesi in due aliquote. Tieni 100 microlitri come controllo non colorato e usa i restanti 100 microlitri come campione colorato. Aggiungere un microlitro DAPI da una soluzione di un milligrammo per millilitro al campione colorato per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.

Mescola delicatamente pipettando e incuba a temperatura ambiente al buio per cinque minuti. Imposta il citometro di flusso per usare il laser viola a 405 nanometri e rileva usando 448 per 45 nanometri. Eseguire prima il campione di controllo non colorato e acquisire almeno 10.000 eventi della popolazione totale.

Genera un grafico dell'area di scatter in avanti rispetto all'altezza della scatter in avanti per distinguere i singoletti dai doppietti e aggregati. Disegna una porta attorno a eventi che mostrano una relazione lineare per mantenere solo i nuclei singolo. Successivamente, si genera un grafico bivariato dell'area di scatter in avanti rispetto all'area di scatter laterale, applicando una barriera ampia che copra l'intera popolazione scatter.

Ora, crea un grafico pseudo colore a densità 2D dell'area di dispersione laterale rispetto all'area violetta di 450 nanometri. Usa il controllo non colorato per definire la fluorescenza di fondo e la posizione del gate guida. Identificare e portare via la popolazione distinta di DAPI positivi corrispondenti ai nuclei intatti.

Prendere 50 microlitri di sospensione per nuclei e aggiungere un microlitro DAPI da una soluzione di un milligrammo per millilitro per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Mescola delicatamente pipettando e incuba a temperatura ambiente al buio per cinque minuti prima dell'imaging confocale. Montare cinque microlitri della sospensione dei nuclei colorati su una vetrata e coprire in vetro pulito con un copricapo.

Successivamente, apri il software del microscopio confocale e osserva i nuclei in campo luminoso 40x. Infine, acquisire immagini confocali utilizzando il microscopio confocale a scansione laser. Eccitare DAPI usando un laser da 405 nanometri e raccogliere emissioni tra 429 e 474 nanometri.

Dopo l'isolamento nucleare e la colorazione con Trypan blue, è stata osservata una popolazione distinta di nuclei senza cellule intate e vitali, confermando una lisi tissutale efficace. I nuclei isolati apparivano come corpi densi, rotondi e blu scuro al microscopio, indicando un isolamento nucleare riuscito. Il tessuto placco calcificato produceva una resa nucleare inferiore e una qualità nucleare ridotta.

La citometria di flusso del controllo non colorato ha rilevato il 77,88% di singoleti e lo 0,19% di eventi DAPI positivi, riflettendo l'autofluorescenza di base. Il campione colorato con DAPI ha mostrato il 68,1% di singoletti e il 25,31% di nuclei positivi per DAPI, indicando un chiaro spostamento di fluorescenza. L'analisi dell'istogramma ha mostrato uno spostamento di fluorescenza verso destra dei nuclei colorati da DAPI rispetto alla popolazione di nuclei non colorati.

L'imaging confocale del campione colorato ha mostrato nuclei fluorescenti blu brillante che apparivano intatti e uniformmente marcati. L'analisi del sequenziamento RNA a nucleo singolo ha identificato 16 cluster cellulari distinti dopo una riduzione della dimensionalità. La sfida più significativa nell'esecuzione di questo protocollo è l'elevata calcificazione in questo tessuto, che compromette gravemente la qualità e la resa dei nuclei.

Il trascritoma facciale è un altro approccio che possiamo utilizzare per ottenere informazioni dettagliate, quindi ci fornirà informazioni sull'espressione genica speciale così come sull'interazione cellula-cellula.