Mappatura della morfologia delle cellule stellate epatiche nei modelli murini di fibrosi epatica

Questo protocollo presenta una pipeline di imaging completa per visualizzare e modellare la morfologia delle cellule stellate epatiche nel tessuto epatico intatto. L'imaging 2D attuale manca la morfologia stellata completa, limitando le intuizioni strutturali e funzionali. Questo protocollo consente catture robuste di architetture 3D complesse.

Per cominciare, pizzica i palmi di un topo anestetizzato per garantire un'anestesia adeguata. Spruzza l'addome con il 70% di etanolo per bagnare il pelo. Con una pinza, solleva la pelle al centro dell'addome allineata con le zampe posteriori e inizia a tagliare la pelle per rivelare l'addome.

Poi usa cotton fiagna bagnata con PBS per spostare intestini e altri organi di lato e sollevare il lobo sinistro. Taglia con attenzione la membrana attaccata tra il lobo sinistro e il lobo caudata. Poi usa una sutura per legare alla base superiore del lobo sinistro.

Taglia il lobo sinistro sotto il nodo di sutura e mettilo da parte per la raccolta e l'elaborazione del campione di tessuto. Usa cotton bob bagnati con PBS per muovere il fegato e rivelare la vena porta. Poi inserisci con attenzione l'ago del catetere nella vena porta a circa metà della sua lunghezza.

Rimuovi l'ago del catetere. Assicurati un riflusso di sangue attraverso il catetere per indicare l'inserimento riuscito. Collega il tubo riempito dalla pompa di perfusione in funzione al catetere e perfondi il fegato con 20 millilitri di PBS.

Clampa l'arteria polmonare sopra il fegato con un emostatico per impedire al PBS di passare attraverso il cuore. Taglia la vena cava inferiore per liberare l'accumulo di pressione. Regola la velocità della pompa a cinque millilitri al minuto.

Dopo 15 minuti, fermare la pompa per cambiare il serbatoio al 4% di paraformaldeide, poi perfondere il fegato con 25 millilitri di paraformaldeide al 4%. Una volta completata la perfusione, si rimuove il fegato dagli organi circostanti tagliando i tessuti connessi. Inserire il fegato in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 25 millilitri di paraformaldeide al 4%.

Posiziona il tubo orizzontalmente su una piattaforma a dondolo durante la notte in una stanza fredda a quattro gradi Celsius a 1,5 giri al minuto. Il giorno successivo, lava il fegato tre volte in PBS su una piattaforma a dondolo per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente a 1,5 giri al minuto. Trasferire il fegato a 20 millilitri di PBS con azida di sodio allo 0,02% e conservare a quattro gradi Celsius.

Taglia i campioni di fegato in pezzi di circa 0,5-1 centimetro cubo. Trasferisci i campioni di fegato in fiale di vetro con tappi a vite. Disidratare i campioni in una serie di metanolo diluito in acqua dal 20% all'80% su un rotatore a ruota a otto rotazioni al minuto per un'ora ciascuno a temperatura ambiente.

Dopo aver eseguito lo sbiancamento del campione, la permeabilizzazione, l'immunomarcatura e la purificazione, incubare il campione nell'etere dibenzilico durante la notte a temperatura ambiente prima dell'imaging (imagining). I campioni possono essere conservati nell'etere dibenzilico fino a un anno senza perdere il segnale di colorazione. Per l'imaging confocale, si posiziona il campione rimosso in una piastra da 35 millimetri con fondo di vetro e un fondo di vetro numero 1,5.

Riempi la ciotola con etil-cinamato per immergere completamente il campione. Poi posiziona il piatto sul palco del microscopio confocale. Acquisire un'immagine tile sul piano più luminoso per catturare un'ampia area del campione usando il formato 1024 per 1024 e una velocità di 600.

In base all'immagine tile, seleziona le regioni di interesse per raccogliere una Z-scanning ad alta risoluzione. Successivamente, acquisire una pila Z che copre tutta la profondità del tessuto purificato alla massima risoluzione supportata dal microscopio utilizzando un formato 1024 per 1024 e una velocità di scansione di 600. La perfusione e fissazione riuscita del fegato del topo ha prodotto un colore uniforme pallido, giallo beige.

Una perfusione impropria ha causato la formazione di coaguli di sangue rosso scuro o marrone, che hanno ridotto la chiarezza ottica e portato a un segnale di fondo elevato in queste regioni. La completa trasparenza ottica è stata ottenuta dopo l'incubazione nell'etere dibenzilico, dove il tessuto appariva trasparente rispetto a prima della liberazione. Gli stack Z ad alta risoluzione hanno rivelato processi dendritici fini che si estendono dal corpo cellulare delle singole cellule stellate epatiche.

Sia i campioni di controllo che quelli cronici di tetracloruro di carbonio hanno mostrato segnali fluorescenti forti e stabili sotto microscopia confocale. Questa pipeline mappa riproducibilmente la morfologia delle cellule stellate nel complesso server del microambiente, catturando processi dendritici e relazioni spaziali con le cellule vicine. L'impegno di tempo è una considerazione importante nell'esecuzione del protocollo.

Il processo di bonifica dura circa tre settimane, il che richiede una pianificazione anticipata. Consentendo un'analisi morfometrica 3D precisa, questa piattaforma collega la struttura dei fibroblasti alle funzioni, avanzando le intuizioni sull'omeostasi tissutale e su un meccanismo Z.