Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un protocollo standardizzato di isolamento per occhielli Lewis Rat ad alto rendimento per ottimizzare ressa, purezza, vitalità e longevità funzionale. I metodi esistenti producono occhielli variabili, impuri e a breve durata. Questo protocollo standardizza la digestione, la purificazione e il pooling per migliorare la consistenza e la longevità.

Per cominciare, mettere un ratto soppresso sotto un microscopio. Utilizzando forbici per la pelle, realizza un'incisione a V che parte dalla sintesi pubica verso ciascuna gabbia toracica laterale per accedere alla cavità addominale. Utilizzando una pinza piatta, ritrae l'intestino tenue e crasso sul lato sinistro dell'animale per liberare lo spazio di lavoro della cavità addominale.

Poi usa la pinza piatta e gli emostatici curvi per spiegare il duodeno superiore. Assicurati che il dotto biliare comune e la vena porta epatica siano nel campo visivo. Ora usa gli emostrati curvi per ritrarre il fegato nella direzione del cefalone.

Clampa il dotto biliare comune e la vena epatica da uno a due millimetri dal fegato. Sotto la visuale del microscopio, con pinze piatte e emostatici piatti, mobilita delicatamente il contenuto all'interno del duodeno per liberare lo sfintere dall'audizione. Poi si clampa delicatamente il duodeno circa cinque millimetri da ciascun lato dello sfintere dell'audi per isolare la regione circostante.

Assicurati una compressione minima per preservare l'integrità dei tessuti. Inserisci con attenzione l'ago di una siringa contenente WDM sterile attraverso la parete duodenale. Fai passare l'ago attraverso il corpo dello sfintere e avanzarlo nel dotto pancreatico principale per la perfusione.

Mantenendo una pressione costante, si perfondono da sette a dieci millilitri di WDM nel pancreas a una velocità di circa 500 microlitri al secondo finché il pancreas non si è completamente disteso. Ora, rimuovi entrambi gli emostrati piatti dal duodeno. Poi disseziona delicatamente e libera il pancreas dalle strutture circostanti partendo dalla milza, dallo stomaco, dall'intestino crasso, dal duodeno e dal mesenario.

Sollevare delicatamente il pancreas perfuso con una pinza piatta e utilizzare forbici fine per sezionare eventuali attacchi residui del tessuto connetto. Trasferisci immediatamente il pancreas esportato in una piastra di Petri contenente soluzione di risciacquo fredda e procedi a prelevare il pancreas successivo mentre quello esportato viene pulito. Per pulire il pancreas si utilizza una coppia di pinze curve fine e forbici sezionanti fine per rimuovere con cura linfonodi, tessuto adiposo, medicinali e grandi vasi vascolari dal pancreas perfuso, se presenti.

Trasferire il pancreas pulito in un becher sterile da 600 millilitri contenente 25 millilitri di WDM freddo. Copri il becher con carta stagnola sterile per mantenere la pulizia durante il trasferimento dall'area di lavoro chirurgica a quella di coltura cellulare. Trasferisci il becher in un bagno d'acqua a shaker orbitale impostato a 130 giri al minuto per 10 minuti.

Al quinto minuto, si fa roteare manualmente il becher in senso orario e poi in senso antiorario per aiutare la dissociazione dei tessuti. Al minuto 10, trasferisci rapidamente il vaso e immergilo nel ghiaccio per rallentare l'attività enzimatica. Poi aggiungi un volume uguale di tampone di tempra alla soluzione nel becher per fermare la digestione.

Utilizzando una siringa da 50 millilitri dotata di ago spinale calibro 14, aspirare e espellere delicatamente la sospensione tissutale ripetutamente per dissocare i grandi frammenti tissutori. Trasferire la sospensione in tubi conici da 200 millilitri. Dopo aver centrifugato la sospensione, si decanta con cura il surnatante e si risospende il pellet in 100 millilitri di materiale di lavaggio.

Ora filtra la sospensione attraverso un setaccio sterile da 500 micrometri posto su un becher sterile da 600 millilitri per rimuovere i grossi tessuti non digeriti. Trasferire il filtrato in nuovi tubi conici da 200 millilitri prima di centrifugare nuovamente. Per la purificazione degli occhielli, si utilizza una pipetta sierologica pre-sposata da 10 millilitri per risospendere ogni pellet tissutale in 15 millilitri di soluzione gradiente per due millilitri di volume di pellet.

Mescola delicatamente finché la sospensione non è uniforme. Distribuire con attenzione 15 millilitri della sospensione a celle nel fondo di ciascun tubo conico da 50 millilitri evitando il contatto con le pareti del tubo per garantire gradienti puliti. Poi si utilizza una pompa di siringa per erogare 10 millilitri di ogni gradiente a una velocità di cinque millilitri al minuto, posizionando la punta dell'ago calibro 16 contro la parete interna del tubo per evitare la miscelazione.

Dopo aver centrifugato i tubi, identifica lo strato a occhiello situato alle interfacce tra gli strati di gradiente. Utilizzando una pipetta a filo a filo di soffio, raccogli lo strato di occhielli, trasferisci gli occhielli raccolti in un tubo conico preraffreddato da 200 millilitri contenente cinque millilitri di materiale di lavaggio. Porta il volume a 200 millilitri con il materiale di lavaggio ed esegui i seguenti passaggi di lavaggio e centrifugazione.

Poi, implattando uniformemente gli occhielli in piastre di Petri da 100 millimetri trattate con coltura tissutale utilizzando una piastra ogni cinque pancreas lavorati. Durante l'isolamento di test, la resa era di 3.330 equivalenti per pancreas con un diametro mediano dell'occhiello nel contenitore da 50 a 100 micrometri. La dimensionazione automatica ha prodotto 98.832 oggetti in totale, fortemente correlati con gli equivalenti manuali delle palpebre misurati al giorno zero.

La purezza endocrina era circa del 98,56% basata sulla colorazione con ditozone al primo giorno. Gli indici di stimolazione erano 9,37 al primo giorno, 8,34 al terzo giorno e 6,7 al settimo giorno, senza differenze significative tra i punti temporali. Questo metodo consente lo studio del trapianto di occhioli, della funzione delle cellule beta, della inversione del diabete, dell'incapsulamento dell'occhiello e delle interazioni immunitarie o microambientali degli occhielli.

Questo protocollo può essere applicabile a trapianti preclinici, modellazione del diabete, studi di incapsulamento e saggi funzionali ad invito che richiedono occhielli Lewis Rat ad alta purezza.