Name: Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T12:53:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Scopri un protocollo standardizzato per isolare isole pancreatiche da ratti Lewis con elevata resa, purezza e vitalità. Questo metodo combina digestione enzimatica e gradiente di densità per studi di diabete e trapianto.

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<ol><li>Grattoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+cellular+therapeutics+for+type+1+diabetes+mellitus%3A+progress%2C+challenges%2C+and+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead.</a> Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).</li>
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<li>Dono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+collagenase+digestion+for+islet+isolation+from+48-hour+cold-preserved+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas.</a> Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).</li>
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<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjustment+of+digestion+enzyme+composition+improves+islet+isolation+outcome+from+marginal+grade+human+donor+pancreata%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Adjustment of digestion enzyme composition improves islet isolation outcome from marginal grade human donor pancreata.</a> Cell Tissue Bank. 8, 187-194 (2007).</li>
<li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics%3A+comparison+study+with+Ficoll%2C+iodixanol+and+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3 (4), 144-149 (2011).</li>
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<li>Paez-Mayorga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neovascularized+implantable+cell+homing+encapsulation+platform+with+tunable+local+immunosuppressant+delivery+for+allogeneic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation.</a> Biomaterials. 257, 120232(2020).</li>
<li>Paez-Mayorga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+niche+with+local+immunosuppression+for+islet+allotransplantation+achieves+type+1+diabetes+reversal+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Implantable niche with local immunosuppression for islet allotransplantation achieves type 1 diabetes reversal in rats.</a> Nat Commun. 13, 7951(2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>21 G x 2 in. Ago BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>500 & micro; m Telaio in ottone e schermo in acciaio inox 304, diametro 3" x 1" di profondità (setaccio numero 35)</td><td>McMaster-Carr</td><td>34735K525</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Air-Tite sterili, serratura Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-178</td><td></td></tr><tr><td>Biogel PI UltraTouch M</td><td>M&ouml; Inlycke</td><td>42665</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di Bonn; Straight; Punte affilate; Lunghezza della lama di 15 mm; 3 1/2" di lunghezza totale</td><td>Roboz</td><td>RS-5840</td><td></td></tr><tr><td>Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9956482</td><td></td></tr><tr><td>Serie Cell-IQ 5,8 piedi cubi. Incubatore di laboratorio CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura Corning 100 mm Non trattato con TC</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Corning, 500 mL, normale, test USDA per la sicurezza (inattivato dal calore)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente dell'isolotto di Corning 1,069 (densità 1,069 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-815-CIS</td><td>Richiede una richiesta speciale da parte dell'azienda</td></tr><tr><td>Gradiente dell'isole di Corning 1,096 (densità 1,096 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-691-CIS</td><td>Richiede una richiesta speciale da parte dell'azienda</td></tr><tr><td>Gradiente dell'isola di Corning 1,108 (densità 1,108 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-692-CIS</td><td>Richiede una richiesta speciale da parte dell'azienda</td></tr><tr><td>Sottocuscinetti Covidien Tendersorb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-225-102</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I Grado II</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Tubi centrifughe conici ad alta chiarezza da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Lamina di alluminio Fisherbrand, rotolo a scartamento standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Spugne di garza non tessute</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-559</td><td></td></tr><tr><td>Bechers Fisherbrand in vetro riutilizzabile, resistenti e a bassa forma</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101600</td><td></td></tr><tr><td>Mircoscopio a fluorescenza&nbsp; BZ-X810</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glucosio</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Portaago micro Halsey</td><td>Strumenti scientifici di qualità</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcio, magnesio, niente fenolo rosso</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Emostatica Classic Crile Lunghezza 5-1/2 Pollice</td><td>McKesson</td><td>1231217</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Hudson (Ewald)</td><td>Roboz</td><td>RS-5238</td><td></td></tr><tr><td>Agolo ipodermico monoject lunga 1-1/2 pollice Parete regolare calibro 16 senza sicura</td><td>McKesson</td><td>43481</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liberase T-Flex, Grado di Ricerca</td><td>Roche</td><td>5989132001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di VITALITÀ/MORTO/Citotossicità, per cellule di mammiferi</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; L3224</td><td></td></tr><tr><td>Pacchetto software MATLAB</td><td>MathWorks</td><td><a href="https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML">https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML</a></td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa programmabile NE-4000 a due canali</td><td>Pompa a siringa</td><td>NE-4000-US</td><td></td></tr><tr><td>AGO, IPOTIRO FORZA DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINT</td><td>McKesson</td><td>408877</td><td></td></tr><tr><td>Nunc coltura cellulare/piastre di Petri</td><td>Termo-Scientifico</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina' Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, nessun glucosio</td><td>Gibco</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (stock da 100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST 16R</td><td>Termo-Scientifico</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa 304 in acciaio inox</td><td>Milipore Sigma</td><td>Z117013-1EA</td><td></td></tr><tr><td>PANNO CHIRURGICO, USA E GETTA, 36 IN X 100 YD</td><td>Covetrus</td><td>10408</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche - ToughCut</td><td>Strumenti scientifici di qualità</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per fasciatura per il pollice da 4,5" con una larghezza delicata della punta di 1,3 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrifuga Thermo Scientific Nunc da 200 mL</td><td>Termo-Scientifico</td><td>14-962-17</td><td></td></tr><tr><td>Adattatori e cuscini per bottiglie centrifughe Thermo Scientific Nunc</td><td>Termo-Scientifico</td><td>12-565-283B</td><td></td></tr><tr><td>TSDUB15 15L Dubnoff Bagno d'acqua scuotendo</td><td>Fisher Scientific</td><td>300610298</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 Rotore a secchio oscillante 4 x 400 mL</td><td>Termo-Scientifico</td><td>75003181</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S-50-HL</td><td>Tygon</td><td>AAXoooo3</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA per insulina ultrasensibile per ratti</td><td>Chimica a Cristallo</td><td>90060</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Pancreatic Islet Isolation and Purification from Lewis Rats Using Enzymatic Digestion and Density-Gradient Separation

I seguenti risultati rappresentano un tipico isolamento di isolotti eseguito con il metodo descritto, con dodici pancreas di ratto Lewis processati in parallelo.
Distribuzione di resa e dimensione
Conteggio manuale delle aliquote e conversione IEQ
Due aliquote indipendenti da 100 μL sono state ottenute dalla sospensione mista degli isolotti, come descritto nella sezione "Conteggio degli isolotti", Passo 6.1, e conteggiate per contenitori di diametro (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). I conteggi venivano convertiti in equivalenti degli isolotti (IEQ; riferimento di 150 μm) utilizzando tabelle di equivalenza standard ed estrapolati al volume totale di sospensione (vedi Figura 4A). Nell'isolamento di prova (n = 12), la resa era di 3330 IEQ/pancreas con un diametro mediano dell'isolotto nel contenitore da 50-100 μm. Replicare le aliquote concordate con un 18,8% per bin (coefficiente di variazione), indicando una variazione moderata ma attesa con l'uso di metodi di conteggio manuale. Nelle precedenti 14 isolazioni di isolotti, questo metodo ha prodotto una media di 1353 IEQ/pancreas (SD 607).
Quantificazione automatica dell'intera piastra
Per confrontare l'IEQ manuale, le immagini in campo chiaro sono state acquisite a D1 usando un microscopio e cucite per generare compositi a intero piatto (obiettivo 4×; esposizione 1/100 s). La dimensionamento automatizzato e la quantificazione degli oggetti venivano eseguiti utilizzando Fiji e codificando con una soglia di dimensione predefinita di 50-600 μm. Le immagini sono state inizialmente preprocessate per ridurre la variazione dello sfondo e migliorare l'uniformità del contrasto. Le strutture degli isolotti sono state identificate in base alle differenze di intensità rispetto ai tessuti circostanti, generando maschere binarie per oggetti. Isolotti adiacenti o parzialmente toccanti venivano separati per evitare una sottostima del numero di oggetti. Gli oggetti al di fuori dell'intervallo di dimensioni specificati sono stati esclusi per rimuovere detriti e tessuto non isolato. Per ogni oggetto trattenuto, sono stati estratti parametri morfometrici tra cui area e diametri degli assi x e y. Gli isolotti venivano poi assegnati per diametro, e l'IEQ veniva calcolato moltiplicando il numero di isolotti in ogni contenitore di dimensioni per il fattore di conversione corrispondente. La dimensionamento automatica ha prodotto un totale di 98.832 oggetti, con diametri medi sugli assi x e y rispettivamente di 117 μm e 116 μm, e un totale stimato di 16.350 IEQ, fortemente correlato con l'IEQ manuale misurato a D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; vedi Figura 4A-C).
Perdita cellulare degli isolotti
Le immagini dell'intera piastra sono state acquisite 2 ore dopo la purificazione e di nuovo al Giorno 1 (D1), utilizzando la stessa metodologia nella "Quantificazione automatica dell'intera placca" per valutare la stabilizzazione precoce degli isoli ("shedding"). Il numero di oggetti è cambiato dello 0,9% e l'IEQ del -6,11% da 2 ore a D1 (vedi Figura 4D). Il confronto accoppiato dei diametri degli isolotti tra D0 e D1 ha mostrato una diminuzione mediana statisticamente significativa di 2 μm (test Wilcoxon signed-rank, p = 0,0136, n = 2820). Tuttavia, la piccola entità di questo cambiamento difficilmente sarà biologicamente o clinicamente significativa.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig4.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Valutazione quantitativa della distribuzione delle dimensioni degli isoli, correlazione e precoce perdita di iotti. Riepilogo grafico delle misurazioni degli isolotti ottenute tramite analisi manuali e automatizzate. (A) Giorno 0 (D0) distribuzione delle dimensioni degli isolotti basata sulla quantificazione manuale tra contenitori IEQ equivalenti agli isolotti standardizzati. (B) Giorno 1 (D1) distribuzione delle dimensioni degli isolotti determinata da misurazioni automatizzate basate su immagini sugli stessi contenitori standardizzati delle dimensioni IEQ. (C) Correlazione dei conteggi tra la quantificazione manuale del D0 e la quantificazione automatica del D1 tra i contenitori della dimensione IEQ. (D) Diagramma a scatola della distribuzione dei diametri degli isolotti tra D0 e D1 per misurazioni automatizzate della stessa placca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Purezza (contenuto endocrino vs. esocrino)
Colorazione con ditizone (DTZ)
Su D1, un'aliquota di isolotti (n = 451) è stata colorata con DTZ per 30 secondi a temperatura ambiente e immediatamente fotografiata con microscopia a campo chiaro (obiettivo 4×; esposizione 1/20 s). Alle Fiji, i pixel di sfondo furono rimossi in modo che l'area residua dei pixel corrispondesse all'area totale dell'isolotta. Le regioni esocrine DTZ-negative, identificate da un contrasto di colore più scuro, venivano selezionate manualmente tramite uno strumento lasso, e l'area di ciascuna regione di interesse veniva automaticamente registrata in pixel. La purezza endocrina è stata calcolata come la percentuale di pixel DTZ positivi rispetto al totale dei pixel dell'isolotto, ottenendo una purezza di 98,56 ± 0,38% (Figura 5A).
Fattibilità e prestazioni funzionali
Secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS)
Ad ogni punto temporale (D1, D3, D7), 15 isolotti di dimensioni abbinate venivano selezionati a mano e posizionati in singoli pozzi di una piastra a 24 pozzi, preparati in quadruplicate. Gli isolotti sono stati incubati a 37 °C 5% CO2 nel tampone di Krebs sotto un protocollo di stimolazione del glucosio basso-alto-basso: prima in glucosio basso (2,8 mM, 60 min), seguito da un glucosio alto (16,7 mM, 60 min, vedi Tabella 1). Le frazioni di effluente sono state raccolte alla fine di ogni periodo di incubazione e le concentrazioni di insulina sono state quantificate utilizzando un saggio ELISA sull'insulina di ratto. Gli indici di stimolazione sono stati calcolati come il rapporto di secrezione di insulina durante condizioni di glucosio alto a basso. Gli indici di stimolazione erano 9,37, 8,34 e 6,7, rispettivamente nei giorni 1, 3 e 7, senza differenze significative (Figura 5B).
Macchiatura viva/morta
A D1, D3 e D7, 15 isolotti furono selezionati a mano e colorati con il kit di vitalità Live/Dead secondo le istruzioni del produttore. Per un breve periodo, gli isolotti sono stati incubati nella soluzione di colorazione Live/Dead per 30 minuti a 25 °C, poi fotografiati sotto impostazioni coerenti al microscopio per garantire la comparabilità tra i punti temporali (obiettivo 4X; esposizione 1/30 s, filtri Texas Red e GFP). La vitalità è stata quantificata utilizzando uno script Python che impiegava scikit-image per la segmentazione degli isolotti e la misurazione della fluorescenza. Gli isolotti sono stati identificati combinando i canali di fluorescenza verde e rosso, applicando il metodo di soglia di Li per generare una maschera binaria e utilizzando la segmentazione del bacino idrografico per separare gli isolotti che si toccano. Gli oggetti venivano filtrati per area per escludere detriti e reperti. Per ogni isolot, la fattibilità è stata calcolata come la percentuale di densità integrata viva (pixel verdi) rispetto alla densità integrata totale (pixel verdi più rossi). I risultati hanno mostrato una vitalità del 68 ± 9% a D1, 98,2 ± 0,6% a D3 e 100% a D7. Un campione di controllo positivo trattato con etanolo al 70% per 10 minuti ha mostrato una vitalità del 2,7 ± 7,2% (vedi Figura 5C-F).
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig5.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Valutazione della purezza, della vitalità e della reattività funzionale degli isolini. Immagini rappresentative e riassunti quantitativi delle caratteristiche degli isolotti isolati nel tempo. (A) Immagine rappresentativa del 10× campo chiaro degli isolotti colorati con ditizone (DTZ), mostrando isolotti endocrini colorati di rosso e tessuto esocrino non colorato. (B) Valori di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) dell'indice di stimolazione ad alto glucosio/basso glucosio (HG/LG) per i giorni 1, 3 e 7. (C-E) Immagini fluorescenti vive e morte degli isolotti al Giorno 1 (C), Giorno 3 (D) e Giorno 7 (E). (F) Immagine fluorescente viva/morta di isolotti a controllo positivo trattati con etanolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(A) Materiale per lavaggio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Importo (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siero bovino fetale</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Streptococco (10.000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>12,5 mL da 1M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>5 mL da calcio da 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Media della cultura degli isoli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Quantità (mL o g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, nessun glucosio</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siero bovino fetale</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Streptococco (10.000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>11 mL da stock 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piruvato di sodio</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5,5 mL da materiale da 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosio</td>
			<td>5,5 mM</td>
			<td>2,75 mL da calcio da 200 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Soluzione per risciacquo con penicillina e streptomicina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Quantità (mL o g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soluzione salina, 0,9%</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sreptomicina penicillina (10.000 U/mL)</td>
			<td>2%</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(D) Tamponamento di Estinzione</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Quantità (mL o g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siero bovino fetale</td>
			<td>20%</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E) Buffer di Krebs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Quantità (mL o g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH 2O</td>
			<td>-</td>
			<td>975 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>115 mM</td>
			<td>6,72 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>24 mM</td>
			<td>2,02 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,3728 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,0952 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,2775 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Lista delle soluzioni. Composizione e preparazione dettagli per tutte le soluzioni utilizzate durante il protocollo di isolamento e purificazione dell'isoletto. Ogni sottosezione elenca i componenti, le concentrazioni finali, i volumi di preparazione e i numeri di catalogo. (A) Substrato per lavaggio, usato per risciacquare e lavare il tessuto durante la digestione e la purificazione. (B) Mezzi di Coltivazione degli Isolotti, utilizzati per la manutenzione e la vitalità post-isolamento. (C)Soluzione di risciacquo penicillina-streptomicina, usata per sterilizzare e risciacquare il pancreas raccolto. (D) Tampone di tempra, utilizzato per interrompere la digestione enzimatica e preservare la vitalità cellulare. (E) Krebs Buffer, utilizzato durante i saggi GSIS (Glucos-stimulated Insulin) Secretion Buffer.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Numero di pancreas</td>
			<td>Collagenasi (15,38 mg/mL)</td>
			<td>Termolisina (1 mg/mL)</td>
			<td>DNAse (100 mg/mL)</td>
			<td>Buffer funzionante</td>
			<td>600 mL Bechers da usare</td>
			<td>Volume/Becher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>4,5 mL</td>
			<td>2,25 mL</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>450 mL</td>
			<td>5</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>3,6 mL</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>360 μL</td>
			<td>360 mL</td>
			<td>4</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>300 μL</td>
			<td>300 mL</td>
			<td>3</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>2,4 mL</td>
			<td>1,2 mL</td>
			<td>240 μL</td>
			<td>240 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>0,9 mL</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>180 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>0,75 mL</td>
			<td>150 μL</td>
			<td>150 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conc. finale</td>
			<td>0,15 mg/mL</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,1 mg/mL</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Soluzione enzimatica digestiva per quantità di pancreas. Volumi di collagenase, termolisina e DNasi necessari per preparare il Mezzo di Dissociazione Operativo (WDM) per diversi numeri di pancreas di ratto. Le concentrazioni finali di ciascun enzima sono elencate in fondo alla tabella.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Numero di pancreas</td>
			<td>Tubi numero 50 mL</td>
			<td>Volume/siringa</td>
			<td>Numero di 1.096 siringhe</td>
			<td>Numero di 1.068 siringhe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>10 valvole</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>8 tubi</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>6 valvole</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>4 tubi</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>4 tubi</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>2 valvole</td>
			<td>20 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Carico gradiente per quantità del pancreas. Numero di tubi conici da 50 mL e volumi gradienti corrispondenti richiesti per la purificazione degli isolini, in base al numero di pancreas lavorati.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intervallo del diametro dell'isolotto (μm)</td>
			<td>Numero di particelle dell'isolotto (AI)</td>
			<td>Fattore di conversione IEQ</td>
			<td>IEQ per intervallo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-100</td>
			<td>a</td>
			<td>* 0.167</td>
			<td>a * 0.167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>b</td>
			<td>* 0.648</td>
			<td>b * 0,648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-200</td>
			<td>c</td>
			<td>* 1.685</td>
			<td>c * 1.685</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>201-250</td>
			<td>d</td>
			<td>* 3.500</td>
			<td>d * 3.500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>251-300</td>
			<td>e</td>
			<td>* 6.315</td>
			<td>e * 6.315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-350</td>
			<td>f</td>
			<td>* 10.352</td>
			<td>f * 10.352</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 350</td>
			<td>g</td>
			<td>* 15.833</td>
			<td>g * 15.833</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 4: Conversione di equivalenza degli isolini. La conversione dei diametri degli isolotti varia in equivalenti standardizzati degli isolotti (IEQ). La tabella elenca i contenitori osservati nel diametro degli isolini, il numero di particelle di isolotti per intervallo, il corrispondente fattore di conversione IEQ per ogni intervallo di dimensioni e il contributo IEQ risultante per intervallo.

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Pancreatic islets are essential for both clinical islet transplantation and preclinical studies aimed at understanding the mechanisms and progression of ...

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Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

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A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

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Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente (Video) | JoVE Journal

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

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