Protocollo per la dissociazione a singola cellula, sequenziamento dell'RNA e isolamento delle cellule mioepiteliali e dei fibroblasti dalle ghiandole lacrimali e salivari invecchiate

Il mio laboratorio studia come i cambiamenti legati all'età nelle ghiandole salivari e lacrimali influenzino diversi tipi cellulari utilizzando la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. I metodi standard di dissociazione recuperano male cellule epiteliali fragili da ghiandole salivari e lacrimali invecchiate. E il mio protocollo migliora la vitalità delle cellule e consente un'analisi e una selezione affidabile delle singole cellule.

Per cominciare, posizionare il topo eutanasiato supino sul tavolo per la dissezione. Usando pinze sottili e forbici, incisi la pelle tra l'occhio e l'orecchio. Ritrae delicatamente la pelle per esporre la ghiandola lacrimale.

Usando una pinza con punta smussata, solleva leggermente la ghiandola lacrimale. Separare con cura il tessuto connettivo circostante stuzzicandolo delicatamente con un movimento circolare. Identifica i confini visibili della ghiandola lacrimale e separala dai tessuti adiacenti, inclusa la ghiandola parotide.

Poi trasferisci la ghiandola lacrimale in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di PBS freddo su ghiaccio. Al microscopio dissezionale, rimuovere il grasso residuo e rimuovere con cura la capsula del tessuto connettivo dalla ghiandola lacrimale. Metti una piastra di Petri sterile da 35 millimetri sul ghiaccio.

Aggiungi da 800 a 1000 microlitri di PBS freddo al centro della piastra e trasferisci una ghiandola lacrimale nel PBS. Assicurati che il tessuto rimanga immerso nel PBS. Utilizzando due bisturi sterili, trita finemente la ghiandola lacrimale in piccoli frammenti fino a raggiungere una consistenza morbida e pasta.

Raccogli i frammenti di tessuto da un lato del piatto. Aspirare il PBS residuo e lavare i frammenti con un millilitro di PBS fresco e freddo. Trasferire i frammenti di tessuto lavato in una piastra a 12 pozzi contenente due millilitri per pozzetto di mezzo digeritivo preriscaldato.

Metti il piatto in un bagno d'acqua tremante e incuba a 37 gradi Celsius e 60 giri al minuto per 30 minuti. Utilizzando una punta di pipetta a ampio calibro da un millilitro, triturare delicatamente il tessuto 15 volte. Riporta il piatto nel bagno d'acqua che trema e incuba per altri 30 minuti.

Poi, usando una punta normale da un millilitro, triturare delicatamente il campione 10 volte e incubare di nuovo per 30 minuti. Poi triturare delicatamente il campione 10 volte e trasferire la sospensione della cella in tubi microcentrifughe delfini da due millilitri da due millilitri. Aggiungere un millilitro di mezzo bloccante al freddo uno, o BM1, in ciascun pozzo della piastra per raccogliere il residuo di mezzo digeritivo contenente cellule residue e mettere la piastra sul ghiaccio fino al passaggio successivo.

Centrifugare i tubi contenenti la sospensione della cella a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprantantante da ogni tubo. Trasferire il BM1 da ogni pozzetto della lastra contenente celle residue nel tubo corrispondente.

Successivamente, aggiungi 600 microlitri di BM1 freddo in ogni pozzo per risciacquare le cellule rimanenti e trasferisci il lavaggio nel tubo corrispondente da combinare con la sospensione della cella. Sospezioni delicatamente la sospensione della cella. Centrifugare nuovamente i tubi a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprantantante.

Aggiungi un millilitro di Accutase ai pellet cellulari e risospezioni delicatamente le cellule. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius e 60 giri al minuto per cinque-dieci minuti. Usando una punta da pipetta da un millilitro, triturare delicatamente il campione 10 volte.

Poi aggiungi un millilitro di BM2 freddo al tubo per interrompere la reazione enzimatica diluendo l'Accutasi. Centrifugare il tubo a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprantantante. Aggiungere un mezzo contenente DNasi 1 a una concentrazione di 200 unità per millilitro al tubo per risospendere le cellule e riempire il tubo fino in cima.

Incubare il tubo per 10 minuti a temperatura ambiente, e risospendere delicatamente una volta dopo cinque minuti. Nel frattempo, posiziona un colino a celle da 70 micrometri su un tubo conico da 15 millilitri e pre-inhumida il colino con un millilitro di BM3. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare sul colino.

Aggiungi un millilitro di BM3 nel tubo di raccolta originale per risciacquare e trasferisci il risciacquo sullo stesso colino. Lava il colino con altri cinque millilitri di BM3. Infine, determinare la concentrazione cellulare e la vitalità della sospensione cellulare filtrata utilizzando la colorazione blu di tripano e un contatore cellulare automatico.

Prosegui con applicazioni a valle, come il sequenziamento di RNA a singola cellula per il profiling dell'espressione genica, o la selezione cellulare basata su citometria di flusso di popolazioni cellulari marcate fluorescenti. L'analisi UMAP dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha identificato popolazioni epiteliali e stromali ben rappresentate nella ghiandola lacrimale, incluse cellule mioepiteliali e fibroblasti, oltre a popolazioni immunitarie diversificate. Le ghiandole lacrimali invecchiate contenevano plasma abbondante e cellule B attivate che esprimevano IGHM e IGHD.

La citometria a flusso sequenziale ha permesso la separazione chiara delle cellule mioepiteliali positive a EpCAM e GFP dalle cellule mural negative a EpCAM e positive a GFP. I fibroblasti GFP-positivi che esprimono PDGFR alfa erano EpCAM negativi, permettendo la discriminazione dalle cellule epiteliali. Nei topi PDGFR alfa e EGFP, tutte le cellule positive a GFP hanno anche espresso collagene uno, confermando l'identità dei fibroblasti.

L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che il 99,6% delle cellule GFP-positive corrispondeva a cellule immunocolorate da PDGFR alfa. Questo protocollo è progettato per isolare singole cellule vitali dalle ghiandole lacrimali per la caratterizzazione molecolare di popolazioni epiteliali, stromali e immunitarie. La principale sfida è minimizzare lo stress meccanico ed enzimatico durante la dissociazione di tessuti fragili invecchiati, mantenendo al contempo un'elevata vitalità cellulare per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Seguendo questa procedura, le cellule isolate possono essere utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, il sequenziamento di RNA in massa e il profiling molecolare di specifiche popolazioni cellulari. Le cellule ordinate possono anche essere coltivate per saggi funzionali a valle.