Name: Valutazione di sferoidi 3D per studi di trasduzione con AAV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Scopri una piattaforma di sferoidi 3D per valutare la potenza e la cinetica di espressione dei vettori AAV nelle terapie geniche. Questo metodo consente analisi quantitative in tempo reale su diverse linee cellulari.

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Gli autori ringraziano Morten Seirup e Trish Hoang per aver fornito il plasmide per la produzione di nanoluciferasi AAV e i reagenti del substrato vivente. Questo progetto è stato sostenuto da un'assegnazione al Programma di Partecipazione alla Ricerca ORISE presso il CBER, U.S. Food and Drug Administration, gestito dall'Istituto Oak Ridge per la Scienza e l'Istruzione nell'ambito di un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti e la FDA.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Presentiamo qui una piattaforma tridimensionale in vitro&#160; semplificata per lo sviluppo e il test dell'efficacia degli AAV. Questa piattaforma sfrutta un'efficienza di trasduzione maggiore, un'elevata sensibilità e una previsione traducibile migliore, utilizzando colture cellulari tridimensionali che riproducono più fedelmente l'architettura del tessuto umano. Il sistema riesce a distinguere con successo l'efficacia di trasduzione tra diversi sierotipi di AAV ed elementi regolatori, inclusi vettori a singolo filamento e auto-complementari, in molteplici linee cellulari. Si osserva che, a differenza dei saggi convenzionali in 2D, in cui l'efficienza di trasduzione è spesso definita come la percentuale di cellule positive per il transgene, il sistema di sferoidi 3D non consente facilmente una quantificazione con risoluzione a livello cellulare singolo. Pertanto, in questo studio l'efficienza di trasduzione è definita come l'intensità complessiva del segnale del reporter (fluorescente o luminescente), che riflette il contributo combinato della proporzione di cellule trasdotte e del livello di espressione del transgene per cellula. L'elevata sensibilità dei sferoidi riduce notevolmente la necessità di elevate quantità di prodotto, rendendo il sistema economico, versatile e fisiologicamente rilevante per la ricerca e lo sviluppo degli AAV.
Questo approccio affronta le principali sfide associate ai tradizionali saggi di coltura cellulare in 2D, che si basano sull'adesione a superfici artificiali e mancano di organizzazione cellulare, il che potrebbe&#160;portare a previsioni inaccurate dell'efficacia dei vettori in ambito clinico. Il sistema di sferoidi in 3D riproduce meglio la struttura del tessuto e i modelli di distribuzione dei farmaci, fornendo dati sul comportamento dei vettori che rispecchiano più fedelmente le reali condizioni biologiche22,23. Il protocollo utilizza piastre semplici a bassissimo attaccamento, rendendolo facilmente riproducibile in condizioni di laboratorio standard.
Questo sistema versatile potrebbe essere utilizzato per saggi di neutralizzazione di AAV, per studiare la penetrazione di AAV e per sviluppare esperimenti di co-coltura più complessi al fine di indagare gli effetti di diversi ambienti cellulari sulla trasduzione mediata da AAV. Inoltre, piattaforme ad alto rendimento per lo screening di farmaci e vettori possono essere facilmente integrate con la piattaforma di sferoidi, consentendo l'automazione e la riduzione dei costi nei flussi di lavoro per la scoperta di vettori, al fine di sviluppare prodotti più mirati.
Un importante vantaggio pratico degli sferoidi è la loro capacità di crescere ininterrottamente per settimane senza passaggi cellulari, consentendo studi prolungati dell'attività dei virus AAV. Questo sistema di coltura stabile mantiene importanti interazioni tra le cellule e componenti della matrice, evitando le interruzioni causate dai ripetuti prelievi cellulari necessari nelle colture in 2D24. L'ambiente cellulare preservato supporta l'organizzazione naturale delle proteine e le strutture della membrana, essenziali per valutare il legame e l'ingresso dei virus AAV nelle cellule25.
Sebbene gli sferoidi 3D mostrino un notevole potenziale per le valutazioni della trasduzione da parte dei virus adeno-simili (AAV), presentano anche alcune limitazioni rispetto ai modelli in vivo&#160;, principalmente a causa della loro struttura semplificata rispetto ai tessuti nativi. Gli sferoidi non includono componenti fisiologici essenziali, come la vascolarizzazione per il rilascio del vettore, le cellule immunitarie per la valutazione dell'immunogenicità e le barriere specifiche dei tessuti, ad esempio la barriera emato-encefalica, che potrebbero influenzare in modo significativo l'efficacia degli AAV26. Queste limitazioni indicano che, nonostante gli sferoidi offrano un livello intermedio di complessità tra le colture convenzionali in 2D e i modelli animali in vivo, rimangono insufficienti a riprodurre completamente il microambiente fisiologico necessario per una valutazione completa degli AAV.
Il protocollo degli sferoidi presentato qui descrive un singolo tipo cellulare alla volta. Questo protocollo può essere sviluppato per includere da 2 a 3 tipi cellulari aggiuntivi che si aggregano in una struttura tridimensionale di base. Modelli 3D più complessi, come gli organoidi o i sistemi microfluidici, sono sistemi multicellulari che riproducono la diversità cellulare e l'organizzazione di organi specifici, contenenti 10 o più tipi cellulari distinti disposti secondo schemi simili a quelli dei tessuti. Tali organoidi 3D avanzati possono includere colture di cellule multiple27, colture incorporate in idrogel, tecniche a goccia sospesa e piattaforme microfluidiche11,27,28. Sebbene questi metodi offrano un'architettura tissutale più complessa che potrebbe contribuire a una migliore comprensione della biologia dei virus AAV, richiedono in genere reagenti e attrezzature più specializzati e una notevole competenza tecnica. Al contrario, gli sferoidi 3D formati in piastre con adesione ultra-bassa sono notevolmente più semplici e risultano adatti a molti laboratori grazie al loro basso costo e alla riproducibilità.
Tra i passaggi critici per l'implementazione corretta di questo protocollo vi è il mantenimento di un'elevata vitalità cellulare, poiché cellule compromesse possono alterare la formazione degli sferoidi e l'efficienza di trasduzione. L'uso di piastre a adesione ultra-bassa e l'ottimizzazione della centrifugazione sono altrettanto fondamentali per ottenere sferoidi compatti. È essenziale ottimizzare il MOI per ogni tipo cellulare e sierotipo di AAV al fine di evitare segnali deboli o fenomeni di saturazione. La scelta del metodo di rilevamento appropriato è anch'essa cruciale, in particolare per analisi cinetiche, nelle quali è richiesta la compatibilità con sistemi di imaging cellulare vitale continuo. Diversi aspetti tecnici sono importanti per un'interpretazione accurata della trasduzione AAV in sferoidi tridimensionali.
Un segnale di trasduzione scarso o assente può derivare da una titolazione virale bassa, da un MOI subottimale o da un tempo di incubazione insufficiente; questo problema può essere risolto verificando i titoli virali, ottimizzando l'MOI e prolungando il tempo di incubazione (tipicamente 3–5 giorni). Segnali di fluorescenza o luminescenza deboli possono indicare un'espressione bassa del transgene o una penetrazione limitata del reagente all'interno della struttura tridimensionale, aspetti che possono essere migliorati ottimizzando le impostazioni di esposizione o concedendo ulteriore tempo per la diffusione del substrato. Una difficoltà significativa in alcune linee cellulari, come le cellule HeLa, è l'autofluorescenza, che può causare un segnale di fondo elevato e una sensibilità ridotta nei saggi basati sulla fluorescenza. Per affrontare questa limitazione, abbiamo implementato un sistema di reporter basato sulla nanoluciferasi luminescente, che garantisce un rapporto segnale-rumore migliore e consente un rilevamento più accurato della trasduzione in presenza di sfondi autofluorescenti. Inoltre, il segnale di fondo può derivare da una soglia impostata in modo errato o da fluorescenza legata al mezzo; pertanto, va controllato utilizzando pozzetti non trattati (MOI = 0) per definire i livelli di base. Infine, la saturazione del segnale a valori elevati di MOI può verificarsi a causa di un eccesso di virus o di limitazioni del rilevatore; tale fenomeno può essere attenuato riducendo l'intervallo di MOI e ottimizzando le impostazioni di esposizione del rilevatore per mantenere le misurazioni entro il range dinamico lineare.
Nel complesso, questa metodologia basata su sferoidi 3D fornisce un sistema semplificato e riproducibile per valutare la trasduzione, la potenza e la cinetica dei vettori AAV. Colmando il divario tra i saggi convenzionali in 2D e gli studi in vivo, essa consente uno sviluppo dei vettori più informato e supporta il progresso di strategie di terapia genica clinicamente rilevanti.

I vettori AAV sono diventati uno dei sistemi preferiti per il trasferimento genico in applicazioni in vivo grazie al loro profilo di sicurezza e alla capacità di indurre un'espressione genica persistente1. La terapia genica con AAV sta ottenendo successo nel trattamento di numerose malattie rare, con centinaia di prodotti attualmente in fase di sviluppo2. Inoltre, tra le nuove applicazioni vi è il rilascio in vivo di componenti per la modifica del genoma, come Cas9, che ha un notevole potenziale nel supportare il trattamento di patologie difficili da curare3. Tra le principali sfide dello sviluppo vi sono i costi elevati di produzione e la capacità limitata delle attuali prove in vitro di prevedere la qualità del prodotto e l'efficacia clinica4.
L'avanzamento delle terapie basate sui virus adeno-associati (AAV) è fondamentalmente limitato dalla mancanza di saggi di attività predittivi e standardizzati in grado di prevedere con precisione le prestazioni cliniche4,5. Questi saggi rappresentano un componente critico del processo di sviluppo, poiché vengono utilizzati per diversi scopi, tra cui lo screening di librerie di vettori ingegnerizzati, l'ottimizzazione delle modifiche del capside per un migliore indirizzamento e la valutazione del tropismo tissutale specifico. Inoltre, consentono di caratterizzare l'influenza delle sequenze regolatorie sull'espressione del transgene6. Oltre alla selezione dei candidati, i saggi di trasduzione AAV supportano anche fondamentali controlli di qualità nella produzione, attraverso saggi di potenza utilizzati per il rilascio dei lotti, gli studi di comparabilità tra lotti e le valutazioni di stabilità6,7.
La sfida scientifica consiste nello sviluppare saggi in grado di catturare la complessità delle interazioni vettore-ospite mantenendo al contempo una fattibilità pratica per l'uso routinario7,8. Gli approcci attuali includono l'utilizzo di linee cellulari immortalizzate che rappresentano l'organo bersaglio in colture tradizionali in monocstrato bidimensionale. Queste condizioni di coltura presentano una scarsa rilevanza fisiologica e richiedono dosi elevate di farmaco, creando un divario significativo tra le previsioni ottenute in laboratorio e la traslazionalità clinica. Linee cellulari ingegnerizzate di nuova generazione, come sistemi con sovraespressione di AAVR o attivati mediante CRISPR, rappresentano progressi importanti ma non riescono a riprodurre l'architettura tridimensionale e le interazioni con la matrice extracellulare tipiche dei tessuti nativi9,10,11. Modelli di nuova generazione in grado di simulare meglio i microambienti in vivo potrebbero colmare questa lacuna traslazionale12,13,14.
Di recente abbiamo sviluppato un sistema in sferoidi 3D ottimizzato per la trasduzione con AAV, al fine di migliorare la traslabilità dei saggi di trasduzione con AAV. Questo sistema aumenta significativamente l'efficienza di trasduzione con AAV in molteplici linee cellulari e sierotipi di AAV rispetto ai saggi 2D considerati standard di riferimento. Oltre al miglioramento della sensibilità e al risparmio del prodotto utilizzato nel saggio, questi modelli superano i monociti 2D fornendo interazioni cellula-cellula realistiche che variano in base alla posizione cellulare all'interno del sferoide. Inoltre, permettono un'indagine significativa sulla penetrazione dei farmaci, simulando condizioni organiche reali11,15,16. Inoltre, questo approccio basato su sferoidi offre vantaggi pratici rispetto a sistemi più complessi come organoidi o colture cellulari miste, poiché utilizza attrezzature di laboratorio standard ed evita l'impiego di mezzi specializzati o supporti specifici. Questa semplicità garantisce riproducibilità e scalabilità, rendendolo particolarmente adatto per test di routine nella terapia genica e per i flussi di lavoro di sviluppo di vettori17.
Questa piattaforma di sferoidi 3D è particolarmente adatta per applicazioni che richiedono una rilevazione sensibile della trasduzione da parte di AAV a basse dosi e la valutazione comparativa di progetti di genoma virale. Consente inoltre la valutazione del tropismo dipendente dal sierotipo. È particolarmente vantaggiosa per linee cellulari con efficienza di trasduzione relativamente bassa, che richiedono alte dosi di AAV nelle colture convenzionali in 2D. In questi contesti, la sensibilità aumentata e la maggiore rilevanza fisiologica della piattaforma 3D risultano fondamentali. Tuttavia, questo sistema potrebbe essere meno adatto per studi che richiedono componenti immunitari, somministrazione vascolare o complessità tissutale completa. Ciò avviene perché i sferoidi non riproducono pienamente l'ambiente in vivo&#160;.
Pertanto, presentiamo un protocollo semplice per sferoidi tridimensionali ottimizzato per saggi di trasduzione AAV, con due letture critiche e complementari: efficienza di trasduzione (definita qui come segnale totale del reporter per sferoide) e cinetica di trasduzione. Questo metodo fornisce una piattaforma informativa, fisiologicamente rilevante ed economicamente vantaggiosa per la valutazione della potenza degli AAV, la progettazione di vettori e i saggi di neutralizzazione.

<table><tbody><tr><td>Incubatrice a 37 °C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Condizioni standard di coltura</td></tr><tr><td>Cellule A375</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Plasmide AAV1</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV2</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV5</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV8</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV9</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Lettore di piastre BioTek GEN5</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Rilevazione finale di fluorescenza o luminescenza</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Mantenere la sospensione degli sferoidi</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; Soluzione salina tamponata al fosfato per colture cellulari (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS per risciacquare le cellule</td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio, integrato con GlutaMAX e piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Mezzo di crescita completo</td></tr><tr><td>Inibitore Extracellular NanoLuc&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Elimina qualsiasi segnale di Nanoluc&amp;reg; proveniente dall'ambiente extracellulare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Serum bovino fetale (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Fornire fattori di crescita</td></tr><tr><td>Cellule HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Cellule HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Cellule HEP3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Cellule HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Cellule Huh7</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Microscopio invertito IncuCyte S3</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Monitoraggio della formazione e crescita degli sferoidi</td></tr><tr><td>Imager IVIS Spectrum</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Rilevazione finale della luminescenza</td></tr><tr><td>Saggio cellulare vivente Nano-Glo&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Reagente substrato luminescente per il rilevamento in cellule vive</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Prevenire la contaminazione batterica</td></tr><tr><td>Flaconi per colture tessutali T75 con ventilazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Flaconi per la crescita delle cellule</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Distacco enzimatico delle cellule</td></tr><tr><td>Piastre con attaccamento ultra-basso</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Impedire l'adesione cellulare per favorire la formazione di sferoidi</td></tr></tbody></table>

valutazione di sferoidi 3d per studi di trasduzione con aav

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

I virus adeno-associati (AAV) sono vettori potenti utilizzati per il trasferimento genico nei prodotti di terapia genica. Il loro sviluppo richiede sistemi in vitro&#160; in grado di rilevare in modo affidabile le differenze nella progettazione del vettore, nelle prestazioni del sierotipo, nella forza degli elementi regolatori e nella cinetica dell'espressione. Tali sistemi devono inoltre supportare applicazioni come la valutazione della potenza e l'ottimizzazione del vettore. In questo studio descriviamo una piattaforma semplificata in tre dimensioni, basata su sferoidi, ottimizzata per valutare la potenza degli AAV, la cinetica dell'espressione del transgene e l'efficacia di trasduzione specifica per sierotipo in diverse linee cellulari. Sferoidi uniformi vengono generati utilizzando piastre con adesione ultra-bassa e mantenuti in condizioni che ne preservano l'architettura stabile e consentono un'analisi mediante imaging a lungo termine. Dopo la trasduzione con AAV, i segnali fluorescenti o luminescenti vengono monitorati in tempo reale mediante sistemi di imaging su cellule vive. Questo approccio permette una valutazione quantitativa del segnale del reporter, della risposta alla dose, dell'attività degli elementi regolatori e del tempo di insorgenza, grazie a un imaging cinetico continuo. La piattaforma è in grado di discriminare efficacemente tra progettazioni di genoma vettoriale potenti e deboli, nonché tra diversi sierotipi di AAV. Questo metodo dimostra prestazioni solide sia in linee cellulari a divisione lenta che rapida. Questi risultati ne confermano l'utilità come sistema scalabile e fisiologicamente rilevante per la valutazione e lo sviluppo preclinico della terapia genica.

I sistemi di coltura tridimensionali a sferoide rappresentano un miglioramento rispetto ai modelli convenzionali in 2D per lo sviluppo della terapia genica con AAV. Questa metodologia consente un rilevamento sensibile della trasduzione da parte di AAV a basse dosi, una maggiore rilevanza fisiologica e un monitoraggio a lungo termine robusto. La piattaforma supporta la valutazione della potenza, lo screening ad alto rendimento e l'ottimizzazione del vettore in diverse linee cellulari e sierotipi di AAV.

Valutazione di sferoidi 3D per studi di trasduzione con AAV

I virus adeno-associati (AAV) sono potenti vettori utilizzati per il trasferimento genico nei prodotti di terapia genica. Il loro sviluppo richiede sistemi in vitro che ...

Abbiamo sviluppato una piattaforma sensibile e fisiologicamente rilevante in 3D a sferoidi per valutare l'attività di trasduzione dei virus adeno-associati (AAV) e migliorare la previsione dell'efficacia dei vettori nella terapia genica. Questo protocollo è applicabile per valutare l'attività degli AAV nei test di potenza dei vettori, nello screening di sierotipi, nell'ottimizzazione del transgene, negli studi di neutralizzazione e nella terapia genica preclinica in vitro.Per iniziare, coltivare le cellule in una fiasca per colture cellulari T75 fino al raggiungimento di una confluenza del 70% in condizioni standard. Dopo la tripsinizzazione delle cellule, preparare una diluizione da 1 a 10 per il passaggio cellulare di routine. Incubare nuovamente le cellule fino al raggiungimento di una confluenza del 70%, quindi raccoglierle. Dopo aver valutato la vitalità cellulare, pipettare accuratamente la sospensione cellulare per assicurare un'omogenea miscelazione. Eseguire diluizioni seriali in due volte delle cellule in una piastra a 96 pozzetti con superficie ultra-bassa di adesione, partendo da 1 × 10⁴ cellule per pozzetto in 200 µL. Seguendo il disegno sperimentale indicato, aggiungere un volume di mezzo completo a tutte le righe tranne la riga superiore. Successivamente, aggiungere due volumi di 1 × 10⁴ cellule per pozzetto nella riga superiore. Diluire in serie la riga 1A trasferendo un volume della riga 1A nella riga 1B e procedere in modo analogo per le righe successive. Centrifugare la piastra a ultra-bassa adesione a 350 × g per cinque minuti per far sedimentare le cellule al centro e favorire il contatto cellula-cellula. Incubare a 37 °C, senza disturbare, per 24-48 ore per la formazione degli sferoidi. Attendere tre giorni affinché il diametro raggiunga circa 400 µm. Verificare l'uniformità della dimensione degli sferoidi, assicurandosi che le cellule siano state risospese in modo omogeneo e che le piastre siano posizionate in piano. Monitorare la morfologia degli sferoidi. Selezionare sferoidi maturi che mostrino una marcata adesione cellula-cellula piuttosto che aggregati cellulari lenti.Dopo aver centrifugato le sospensioni cellulari, trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius dotato di uno strumento per l'imaging di cellule vive. Accedere al software di acquisizione. Selezionare "Pianifica acquisizione" e "Scansiona in base alla pianificazione", quindi scegliere "Crea contenitore" come "Nuovo". Successivamente, selezionare il tipo di scansione e scegliere "spheroid" (sferoide). Scegliere i canali di interesse. Selezionare il canale in campo chiaro con contrasto di fase. Quindi scegliere il canale verde o rosso. Impostare l'ingrandimento desiderato a 10x. Selezionare il modello di piastra e la sua posizione nel cassetto. Scegliere le pozzette da acquisire e inserire il nome dell'esperimento. Per l'allestimento dell'analisi, selezionare "Differ analysis" in un secondo momento. Impostare l'aggiunta di scansioni ogni sei ore e continuare la scansione indefinitamente. Controllare giornalmente la crescita dei sferoidi accedendo al software di imaging. Selezionare "Visualizza scansioni recenti" e fare doppio clic sull'esperimento desiderato. Dopo aver selezionato "Campo chiaro" nel pannello dei canali di immagine, utilizzare la funzione "Misura immagine" per misurare i diametri dei sferoidi. Rimuovere la piastra nel giorno in cui si ottiene la formazione ottimale dei sferoidi e utilizzarla per la trasduzione con virus adeno-associato, o AAV.Preparare una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo contenente 297 microlitri di DMEM integrato con il 2% di FBS e privo di antibiotici. Aggiungere 33 microlitri di stock di AAV al mezzo per ottenere una multiplicità iniziale di infezione, o MOI, pari a 1 × 10⁶. Preparare quindi delle diluizioni seriali decimali trasferendo 33 microlitri di ciascuna diluizione in 297 microlitri di mezzo. Aspirare completamente il mezzo dalla piastra di sferoidi precedentemente preparata utilizzando una pipetta multicanale. Trasferire 100 microlitri del MOI desiderato di AAV dalla piastra delle diluizioni alla piastra di trattamento mediante pipetta multicanale. Riposizionare le piastre all'interno dello strumento di imaging. Iniziare il monitoraggio della trasduzione tracciando l'intensità della fluorescenza verde per 72 ore. Aggiungere ogni tre giorni 100 microlitri di DMEM completo per pozzetto per reintegrare i nutrienti. Riposizionare la piastra nello strumento di imaging e iniziare la registrazione dell'efficienza di trasduzione ogni sei ore. Analizzare i dati creando una definizione di analisi specifica per le cellule e i geni reporter di interesse. Eseguire l'analisi finale utilizzando i segnali di fluorescenza. Analogamente, eseguire la trasduzione con AAV in sferoidi 3D contenenti reporter luminiscenti, seguita dall'analisi della trasduzione mediante imaging bioluminescente.Ogni linea cellulare ha mostrato caratteristiche morfologiche distinte e diversi livelli di compattazione dopo tre giorni di semina. Le linee cellulari epatiche hanno formato sferoidi più compatti e densi rispetto alle altre linee cellulari. HEK293T ha assunto un aspetto sferico molto rotondo con un nucleo necrotico ben definito. A375 ha formato un aggregato cellulare di forma irregolare. I sferoidi si sono rivelati altamente suscettibili alla trasduzione con AAV, con una trasduzione intensa rilevata a titoli molto bassi di AAV in diverse linee cellulari per la GFP auto-complementare. La trasduzione dei sferoidi con GFP a singolo filamento è stata osservata a livelli inferiori rispetto alla GFP auto-complementare. È stata osservata una differenza di 100 volte nella fluorescenza relativa tra i transgeni auto-complementari e quelli a singolo filamento a un MOI di 10 alla potenza di 6 nelle cellule HEK293T. Una differenza di tre volte nella fluorescenza relativa è stata osservata tra i transgeni auto-complementari e quelli a singolo filamento nelle cellule HEP3B. Tutti e quattro i sierotipi di AAV sono stati rilevati con successo sia mediante lettore fluorimetrico a piastre che mediante sistema di imaging su cellule vive. AAV2 ha mostrato l'efficacia di trasduzione più elevata, seguito da AAV1 in entrambe le linee cellulari. Tutti i sierotipi di AAV hanno mostrato una trasduzione efficiente utilizzando il sistema luminescente, consentendo una differenziazione precisa dell'efficacia di trasduzione. AAV2 è stato il sierotipo più efficace nei sferoidi di HeLa, mentre AAV9 ha mostrato la minore efficacia di trasduzione. La trasduzione con AAV2 GFP auto-complementare è risultata rilevabile a tassi di infezione bassi come 10 alla potenza di 1, con un aumento evidente del segnale dopo circa 34 ore rispetto alle cellule non trattate. Il segnale di GFP a singolo filamento di AAV2 è stato più debole e più lento rispetto al segnale di GFP auto-complementare.La sfida principale nell'esecuzione di questo protocollo consiste nel mantenere un'elevata vitalità cellulare, produrre sferoidi uniformi e compatti e ottimizzare la dose di AAV per ogni tipo cellulare e sierotipo. Questo protocollo permette di valutare l'espressione e la funzionalità del transgene mediante RT-qPCR, immunoblotting, saggi ELISA e saggi di attività somatica, nonché l'analisi cinetica del tempo di insorgenza. Studi futuri potranno includere colture cellulari miste, organoidi, microfluidica, cellule immunitarie o vascolarizzazione per riprodurre in modo più accurato il microambiente in vivo.

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