Riprogrammazione delle linee di cellule staminali pluripotenti indotte da campioni di rivestimento buffy congelato

Lo scopo di questo protocollo è riprogrammare i buffy coat umani congelati o PBMC in cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo purifica in modo unico il mantello buffy dopo lo scongelamento e identifica una morfologia somatica cellulare indicativa del successo della riprogrammazione. Per cominciare, recupera il mantello buffy congelato derivato dal sangue umano e mettilo sul ghiaccio.

Fai girare delicatamente il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e rimuovi la fiala quando rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio. Trasferire con attenzione il contenuto della fiala goccia a goccia in un tubo conico contenente 12 millilitri di DPBS. Risciacqua la fiala con un millilitro di DPBS e aggiungi il risciacquo al tubo conico contenente le cellule prelevate.

Centrifugare il campione utilizzando un rotore a secchio oscillante a 200 g a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di DPBS contenenti l'1% di FBS. Successivamente, sovrappongi delicatamente la miscela di strato buffy su tre millilitri di soluzione a gradiente di densità, evitando di mescolarsi all'interfaccia.

Centrifuga con un rotore a secchio oscillante a 800 g per 20 minuti a temperatura ambiente con il freno staccato. Utilizzando una pipetta, rimuovere e scartare lo strato superiore di plasma senza disturbare il plasma verso l'interfaccia di gradiente. Poi rimuovi la cellula mononucleare del sangue periferico, o strato PBMC all'interfaccia e trasferiscilo in un tubo pulito da 15 millilitri.

Lavare i PBMC aggiungendo tre millilitri di mezzo di dilatazione e centrifugando a 200 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il soprantantante e risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di espansione contenente citochine come SCF, IL-3, EPO e IGF-1. Placca le celle in un solo pozzo di una piastra a 12 pozzi.

Coltura le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e ossigeno al 20% per 10-14 giorni. Sostituire metà del mezzo ogni due giorni finché non si osserva una densa popolazione di eritroblasti luminosi e rotondi, indicando che le cellule sono pronte per la trasduzione. Tre giorni dopo la trasduzione con il virus Sendai che trasporta i fattori Yamanaka, le cellule si placano su fibroblasti embrionali di topo a due millilitri per pozzo.

Incubare le colture per circa sette giorni, nutrendo le colonie emergenti con substrati hESC a giorni alterni. Posizionare la lastra contenente le cellule trasdotte e le colonie emerse sotto un microscopio dissezionale. Usa il microscopio per individuare una colonia, sollevare e sollevare il coperchio della lastra per esporre il pozzo.

Apri asepticamente la siringa ed esponi l'ago. Guidata dal microscopio, si utilizza la punta dell'ago per staccare la colonia dalle cellule di alimentazione circostanti tracciando il contorno della colonia. Usa la punta dell'ago per tagliare la colonia in pochi pezzi di uguale dimensione.

Se i pezzi non si sono staccati, usa il lato dell'ago per raccoglierli o raschiarli dal piatto finché non fluttuano. Ora usando una pipetta P200, individuare la colonia scelta al microscopio, aspirare la colonia galleggiante con la pipetta e trasferirla in un pozzo della piastra preparata a 24 pozzi. Assicurati che l'intera colonia venga trasferita senza raccogliere altre colonie o cellule nutrite.

Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 20% di ossigeno fino a raggiungere la confluenza desiderata. Identifica le colonie grandi, rotonde e con bordi luminosi pronti a dividersi. Aspira il substrato dal pozzo e risciacqua il campione una volta con un millilitro di DPBS.

Poi rimuovi il DPBS e aggiungi 500 microlitri di buffer di dissociazione EDTA da 0,5 millimolari. Incubare il campione a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per due minuti finché le colonie non si allentano e le cellule si arrotondano. Successivamente, rimuovere la piastra dall'incubatrice e aspirare il buffer di dissociazione EDTA.

Utilizzando una pipetta P1000, raccogli le cellule con un millilitro di mezzo pluripotente umano pipettando delicatamente su e giù finché le colonie non si staccano e si scompaiono leggermente. Trasferire un millilitro di mezzo e cellule in una nuova piastra a sei pozzi contenente un millilitro di mezzo staminale umano pluripotente fresco. Posizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 20% di ossigeno.

Nutrire quotidianamente cellule staminali pluripotenti indotte finché il pozzo non è confluente e pronto a dividersi. Nel frattempo, coprire una teglia da 10 centimetri con 7 millilitri di soluzione di vitronectina da cinque microgrammi per millilitro preparata in DPBS e incubarla a temperatura ambiente per un'ora. Per continuare la divisione, aggiungi da 7 a 10 millilitri di mezzo pluripotente umano al piatto da 10 centimetri e trasferisci le cellule dal piatto a sei pozzi al piatto con un rapporto 1:1, e incuba come dimostrato in precedenza.

Conferma che le cellule nel piatto da 10 centimetri siano confluenti prima di dividere nuovamente le celle. Regola il rapporto di suddivisione in base alla morfologia e densità cellulare, tipicamente usando un rapporto 1:10, e annota il numero di passaggio a ogni passaggio. Infine, caratterizzare le cellule staminali pluripotenti indotte confermando l'espressione del marcatore di staminità NANOG tramite immunofluorescenza.

Differenziare le cellule in linee di ectoderma, mesoderma ed endoderma utilizzando condizioni di coltura definite. Valutare il potenziale di differenziazione colorando PAX6, Brachyury e SOX17, insieme alla perdita di espressione di NANIG. Al termine dell'espansione, i PBMC si differenziarono in eritrottati, apparendo come cellule brillanti e rotonde di dimensioni grandi e piccole.

Mentre le colture prive di queste cellule o che sembravano morte difficilmente riuscivano a riprogrammarsi con successo. La trasduzione e la riprogrammazione riuscite furono caratterizzate dall'emergere di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte su cellule alimentari irradiate, che svilupparono poi la tipica morfologia delle cellule staminali. Mentre le cellule che non adottavano una morfologia simile a quella delle cellule staminali non venivano riprogrammate con successo.

Le cellule staminali pluripotenti indotte riprogrammate con successo hanno mostrato colonie dense e rotonde con bordi lisci e luminosi. I subcloni con morfologia meno ideale, come differenziazione spontanea o centri densi, venivano puliti regolando le condizioni di scissione. Alcune colonie scelte non si espansero con successo.

Oltre alla morfologia, le cellule staminali pluripotenti indotte hanno mostrato staminalità come dimostrato dall'espressione del marcatore di stamino NANOG. Le cellule staminali pluripotenti indotte riprogrammate hanno dimostrato potenziale di differenziazione in ectoderma, mesoderma ed endoderma. Questo protocollo fornisce checkpoint dettagliati per tracciare e prevedere il successo della riprogrammazione.

Per confermare ulteriormente che una linea iPSC sia adatta all'uso, è necessario effettuare cariotipazione, genotipizzazione e regolari test per micoplasmi. Questo protocollo consente la riprogrammazione da popolazioni di pazienti esistenti con giunque buffy coat biobanked, ampliando l'utilità della tecnologia iPSC.