Utilizzo della RMN in soluzione per caratterizzare condensati biomolecolari in condizioni bifasiche
17 aprile 2026
Qui presentiamo protocolli per metodologie NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) e CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT) che consentono la caratterizzazione quantitativa e senza etichettatura dei condensati biomolecolari in condizioni bifasiche, rivelando la partizione molecolare, la dinamica dello scambio, l'idratazione del condensato e la struttura delle gocce senza sedimentazione o marcatura.
Abbiamo sviluppato metodi NMR per studiare i condensati biomolecolari. Questi sono fondamentali per l'organizzazione cellulare, ma le loro informazioni sono implicite in molteplici disturbi. Utilizzando i nostri metodi, indagiamo le proprietà del materiale condensato, analizziamo il meccanismo della loro formazione e monitoriamo cambiamenti a lungo termine come la maturazione del condensato o la fibrillazione patologica delle biomolecole.
Per cominciare, preparare il campione bifasico finale stabilizzato con idrogel di agarosio mescolando le scorte proteiche, RNA o entrambe con il rispettivo tampone caldo di agarosio in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. La concentrazione finale di proteina, o RNA, è tipicamente di 50-500 micromolari per la rilevazione NMR. Inserire il campione bifasico preparato in uno spettrometro, poi bloccare, shim, abbinare e sintonizzare il canale protonico come al solito.
Calibrare la lunghezza dell'impulso di 90 gradi sul canale protonico utilizzando la procedura generale di calibrazione. Poi registra uno spettro monodimensionale soppresso dall'acqua e verifica se lo spettro contiene segnali biomolecolari forti. Se non si osserva o si osserva pochissimo segnale, non procedere con REDIFINE, ma utilizzare invece il CONDENSE-MT.
Registra un esperimento di spettroscopia ordinata per diffusione per variare la intensità del gradiente di diffusione da 2 al 95% in 16 passaggi lineari. Per continuare ad acquisire dati per l'intero set REDIFINE, creare nove nuovi esperimenti PPP GPQ S19 copiando i parametri dell'esperimento iniziale appena eseguito. In ogni esperimento consecutivo, si modifica solo il ritardo di diffusione D20 in passi variabili per coprire l'intervallo da 100 a 1000 millisecondi.
Esegui ciascuno di questi esperimenti con il comando appropriato. Usa l'ultima N per preservare il guadagno del ricevitore durante i 10 esperimenti. Imposta Q Sign con SSB2 come funzione finestra.
Poi estrai la quinta fetta usando il comando appropriato. Faseare lo spettro unidimensionale e salvare i parametri di fase nel dataset bidimensionale. Elaborare il dataset bidimensionale con XF2 ed eseguire la correzione di base con ABS2.
Dopodiché, estrai le 16 fette con il 2D diviso. Ripeti la procedura simile per i restanti nove esperimenti. Controlla almeno le prime quattro o cinque fette per assicurarti che la corretta fase e la correzione di base.
Se necessario, correggi manualmente la fase e la linea di base. Successivamente usa il codice MATLAB adatto per l'analisi. Nel codice, modificare i tempi di diffusione, impostare i valori PG in base alle intensità del gradiente della sonda e assegnare gli esperimenti da uno a dieci in base al numero totale di esperimenti.
Poi adatta i dati secondo il modello REDIFINE usando questo codice. Registra lo spettro soppresso dall'acqua 1D. Se viene osservato pochissimo segnale, procedere con l'esperimento CONDENSE-MT.
Determinare il tasso R1 dell'acqua tramite recupero per inversione T1 per CONDENSE-MT quantitativo. Copia la sequenza di impulsi fornita e la lista VD nelle rispettive cartelle. Dopo aver calibrato l'impulso di protone a 90 gradi, imposta NS a 2, DS a 0, D1 a 20 secondi, SW a 10 parti per milione.
TD2 a 16K e TD1 a 24. Per l'esperimento CONDENSE-MT, copia il set di parametri di Bruker, la sequenza e la lista di frequenza forniti nelle cartelle specifiche di Bruker. Poi regola frequenze e potenza secondo lo spettrometro.
Imposta P1 sulla lunghezza calibrata dell'impulso di 90 gradi e P4 su un microsecondo per l'impulso di eccitazione per evitare l'attenuazione delle radiazioni. Imposta NS a 2, DS a 16, D1 a quattro secondi, SW2 a 20 parti per milione, TD2 a 8k e TD1 alla lunghezza della lista delle frequenze. Imposta SPNAM10 su Squa100.000 e imposta P10 a cinque secondi.
Trova la potenza SP10 che produce irradiazioni di 100 hertz. Regola di conseguenza la potenza SP10 dell'impulso di irradiazione. Esegui l'esperimento pseudo bidimensionale con il comando appropriato e imposta una serie di questi esperimenti pseudo 2D, variando i poteri di irradiazione SP10.
Dopo aver regolato tutti i parametri, esegui il codice per leggere gli spettri NMR, che integrano il segnale dell'acqua e lo salvano in una nuova variabile. Nel recupero per inversione del codice, si regola il percorso ai dati appropriati e si verifica la regione di integrazione dell'acqua. Poi regola il numero dell'esperimento contenente i dati di recupero per inversione.
Impostare tutti i parametri sperimentali e inserire i valori del pool vuoto dell'agarosio precedentemente ottenuti adattando il dataset dell'agarosio in modo simile. Esegui la prima sezione del codice condensato vuoto per ottenere l'adattamento al rilassamento longitudinale dell'acqua. Poi esegui la sezione condense empty del raccordo per avviare la figura in tempo reale che mostra la minimizzazione della funzione di fitting.
Esegui la sezione successiva del codice per determinare le incertezze e tracciare i dati. L'adattamento REDIFINE ha determinato i coefficienti di diffusione nelle fasi diluita e condensata, la popolazione di proteine nella fase condensata, la dimensione media delle goccioline e la permeabilità interfase per il campione del dominio terminale N del FUS. Il segnale NMR del dominio terminale N del FUS è rimasto rilevabile nella fase condensata.
Non è stata osservata alcuna differenza nel profilo di trasferimento di magnetizzazione tra il riferimento dell'agarosio e il dominio N-terminale FUS per campione fasico. Per i condensati di RNA ripetuti CAG, non viene osservato alcun segnale NMR. Di conseguenza, il profilo di trasferimento di magnetizzazione è significativamente diverso dal riferimento dell'agarosio.
L'esperimento CONDENSE-MT ha fornito la caratterizzazione dinamica dei condensati di RNA a espansione ripetuta. L'analisi CONDENSE-MT ha fornito la cinetica dello scambio protonico tra il condensato e l'acqua in massa. L'analisi CONDENSE-MT ha inoltre fornito il tempo di rilassamento trasversale dell'RNA nel condensato e il tasso apparente di rilassamento trasversale dell'acqua in massa.
In questo protocollo, possiamo caratterizzare la proprietà del condensato in uno stato biphasico senza la necessità di un tag chimico. Le gocce coesistono con un ambiente diluito, permettendo lo scambio tra le due fasi che imitano l'ambiente cellulare. I nostri metodi focalizzati sulla caratterizzazione del condensato possono essere integrati dai metodi convenzionali NMR per studiare le interazioni e le dinamiche della struttura molecolare tra le fasi.
In studi futuri, puntiamo a sviluppare modelli di condensati più complessi, adattando la metodologia a sistemi più complessi e, infine, studiare il condensato direttamente nei loro ambienti incellulari.
Panoramica
I condensati biomolecolari formati tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS) svolgono un ruolo cruciale nell'organizzare l'ambiente intracellulare e nel regolare i processi biochimici. La caratterizzazione della composizione, della dinamica e dell'organizzazione interna di questi condensati è una sfida, specialmente in assenza di marcatura esterna. Questo articolo presenta due metodi complementari di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) che consentono un'analisi completa e senza etichette dei condensati biomolecolari nel loro stato bifasico nativo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica biologica
- Biologia strutturale
- Biophysica
Sfondo
- I condensati biomolecolari si formano attraverso la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) ed sono essenziali per l'organizzazione cellulare.
- I metodi tradizionali per lo studio dei condensati spesso richiedono l'uso di marcatori o etichette esterni.
- La spettroscopia NMR offre un approccio senza etichette per analizzare il moto molecolare e l'eterogeneità ambientale.
- Comprendere le proprietà dei condensati è fondamentale per collegarne la struttura alla funzione biologica e alle malattie.
Scopo dello studio
- Sviluppare e dimostrare metodi basati sulla risonanza magnetica nucleare (NMR) per caratterizzare i condensati biomolecolari senza l'uso di marcatori esterni.
- Quantificare il ripartizionamento molecolare, la dinamica di scambio e l'organizzazione interna dei condensati.
- Fornire una visione quantitativa e multidimensionale della struttura e della dinamica dei condensati in condizioni prossime a quelle native.
Metodi Utilizzati
- Approccio NMR basato sulla diffusione-scambio: REstricted DIffusion of INvisible speciEs (REDIFINE).
- NMR con rilevamento dell'acqua mediante trasferimento di magnetizzazione in fase semi-solida: CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT).
- Misura del contrasto di diffusione, dello scambio chimico e del contrasto di rilassamento.
- Analisi delle velocità di scambio molecolare, della dimensione delle goccioline, della permeabilità dell'interfaccia, della dinamica di idratazione e del contenuto di acqua legata.
Risultati principali
- REDIFINE quantifica la frazione di molecole ripartite tra fasi condensate e diluite.
- Determinazione della dimensione delle goccioline e della permeabilità dell'interfaccia mediante misure di diffusione e scambio.
- CONDENSE-MT monitora i condensati tramite protoni dell'acqua in massa, rivelando la dinamica di ripartizione e di idratazione.
- Entrambi i metodi forniscono una caratterizzazione completa e priva di marcatori della struttura e della dinamica dei condensati.
Conclusioni
- L'integrazione di REDIFINE e CONDENSE-MT amplia la cassetta degli strumenti NMR per lo studio della separazione di fase biomolecolare.
- Questi metodi permettono un'analisi quantitativa e multidimensionale dei condensati senza la necessità di impiegare marcatori fluorescenti o sistemi di rilevamento.
- Questo approccio costituisce una base per collegare le proprietà fisico-chimiche dei condensati alle loro funzioni biologiche e alla loro alterata regolazione in condizioni patologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La caratterizzazione NMR senza marcatura dei condensati biomolecolari affronta una lacuna fondamentale nella fase iniziale della scoperta, consentendo un'analisi quantitativa e multidimensionale di assemblaggi in fase separata in condizioni quasi native. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico, sostenendo decisioni informate sui portafogli in punti critici di svolta. L'integrazione di questi metodi NMR nei flussi di scoperta rafforza il collegamento tra le proprietà fisico-chimiche dei condensati e i loro ruoli biologici o patologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della composizione del condensato e dello scambio molecolare senza l'uso di marcatori esterni.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando i tassi di ripartizione e di scambio tra le fasi.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi rivelando la dinamica e l'organizzazione del condensato.
- Facilita il triage del portafoglio distinguendo gli stati funzionali da quelli patologici del condensato.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative e validate della struttura e dell'idratazione dei condensati per saggi successivi.
- Permette la standardizzazione dei saggi fornendo misurazioni riproducibili e prive di marcatori.
- Consente lo screening di modulatori che influenzano la dinamica o il comportamento di fase dei condensati.
- Facilita il riutilizzo della piattaforma su diversi sistemi biomolecolari che mostrano separazione di fase liquido-liquido (LLPS).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le proprietà fisico-chimiche del condensato ai meccanismi rilevanti per la malattia, quando supportato dalla patologia della separazione di fase liquida.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica monitorando le caratteristiche del condensato attraverso diversi modelli.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio fornendo biomarcatori quantitativi e meccanicistici dello stato del condensato.
- Fornisce una riduzione del rischio predittiva per i bersagli coinvolti in disturbi legati alla separazione di fase.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questi metodi NMR si collocano all'interno del percorso di scoperta, che va dalla verifica iniziale delle ipotesi all'identificazione di composti promettenti e alla ricerca preclinica, consentendo una caratterizzazione solida dei meccanismi guidati dai condensati.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi quantificando il partizionamento e lo scambio molecolare.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni di diffusione, scambio e idratazione per confrontare condizioni e supportare le decisioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le proprietà dei condensati ai meccanismi delle malattie quando è implicata la separazione di fase liquida (LLPS).
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma NMR riutilizzabile e priva di marcatori per svariati sistemi di condensati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza e amplia l'analisi dei condensati senza marcatura tra i diversi team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento o interruzione del progetto e una maggiore efficienza nell'uso del capitale, riducendo i rischi associati ai meccanismi biologici fin dalle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di bersagli rilevanti per la separazione di fase a liquido (LLPS), adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in NMR in soluzione e in biofisica della separazione di fase.
- Necessita di accesso a strumentazione NMR ad alto campo e a infrastrutture analitiche adeguate.
- Traggo beneficio da una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro nella preparazione dei campioni e nell'analisi dei dati.
- Adattabile a sistemi di condensati sia dinamici che rigidi, mediante l'uso di metodi NMR complementari.
- Limitato ai condensati compatibili con la rilevazione NMR o con il monitoraggio del protone dell'acqua, come descritto.
