Utilizzo della RMN in soluzione per caratterizzare condensati biomolecolari in condizioni bifasiche
17 aprile 2026
Qui presentiamo protocolli per metodologie NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) e CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT) che consentono la caratterizzazione quantitativa e senza etichettatura dei condensati biomolecolari in condizioni bifasiche, rivelando la partizione molecolare, la dinamica dello scambio, l'idratazione del condensato e la struttura delle gocce senza sedimentazione o marcatura.
Abbiamo sviluppato metodi NMR per studiare i condensati biomolecolari. Questi sono fondamentali per l'organizzazione cellulare, ma le loro informazioni sono implicite in molteplici disturbi. Utilizzando i nostri metodi, indagiamo le proprietà del materiale condensato, analizziamo il meccanismo della loro formazione e monitoriamo cambiamenti a lungo termine come la maturazione del condensato o la fibrillazione patologica delle biomolecole.
Per cominciare, preparare il campione bifasico finale stabilizzato con idrogel di agarosio mescolando le scorte proteiche, RNA o entrambe con il rispettivo tampone caldo di agarosio in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. La concentrazione finale di proteina, o RNA, è tipicamente di 50-500 micromolari per la rilevazione NMR. Inserire il campione bifasico preparato in uno spettrometro, poi bloccare, shim, abbinare e sintonizzare il canale protonico come al solito.
Calibrare la lunghezza dell'impulso di 90 gradi sul canale protonico utilizzando la procedura generale di calibrazione. Poi registra uno spettro monodimensionale soppresso dall'acqua e verifica se lo spettro contiene segnali biomolecolari forti. Se non si osserva o si osserva pochissimo segnale, non procedere con REDIFINE, ma utilizzare invece il CONDENSE-MT.
Registra un esperimento di spettroscopia ordinata per diffusione per variare la intensità del gradiente di diffusione da 2 al 95% in 16 passaggi lineari. Per continuare ad acquisire dati per l'intero set REDIFINE, creare nove nuovi esperimenti PPP GPQ S19 copiando i parametri dell'esperimento iniziale appena eseguito. In ogni esperimento consecutivo, si modifica solo il ritardo di diffusione D20 in passi variabili per coprire l'intervallo da 100 a 1000 millisecondi.
Esegui ciascuno di questi esperimenti con il comando appropriato. Usa l'ultima N per preservare il guadagno del ricevitore durante i 10 esperimenti. Imposta Q Sign con SSB2 come funzione finestra.
Poi estrai la quinta fetta usando il comando appropriato. Faseare lo spettro unidimensionale e salvare i parametri di fase nel dataset bidimensionale. Elaborare il dataset bidimensionale con XF2 ed eseguire la correzione di base con ABS2.
Dopodiché, estrai le 16 fette con il 2D diviso. Ripeti la procedura simile per i restanti nove esperimenti. Controlla almeno le prime quattro o cinque fette per assicurarti che la corretta fase e la correzione di base.
Se necessario, correggi manualmente la fase e la linea di base. Successivamente usa il codice MATLAB adatto per l'analisi. Nel codice, modificare i tempi di diffusione, impostare i valori PG in base alle intensità del gradiente della sonda e assegnare gli esperimenti da uno a dieci in base al numero totale di esperimenti.
Poi adatta i dati secondo il modello REDIFINE usando questo codice. Registra lo spettro soppresso dall'acqua 1D. Se viene osservato pochissimo segnale, procedere con l'esperimento CONDENSE-MT.
Determinare il tasso R1 dell'acqua tramite recupero per inversione T1 per CONDENSE-MT quantitativo. Copia la sequenza di impulsi fornita e la lista VD nelle rispettive cartelle. Dopo aver calibrato l'impulso di protone a 90 gradi, imposta NS a 2, DS a 0, D1 a 20 secondi, SW a 10 parti per milione.
TD2 a 16K e TD1 a 24. Per l'esperimento CONDENSE-MT, copia il set di parametri di Bruker, la sequenza e la lista di frequenza forniti nelle cartelle specifiche di Bruker. Poi regola frequenze e potenza secondo lo spettrometro.
Imposta P1 sulla lunghezza calibrata dell'impulso di 90 gradi e P4 su un microsecondo per l'impulso di eccitazione per evitare l'attenuazione delle radiazioni. Imposta NS a 2, DS a 16, D1 a quattro secondi, SW2 a 20 parti per milione, TD2 a 8k e TD1 alla lunghezza della lista delle frequenze. Imposta SPNAM10 su Squa100.000 e imposta P10 a cinque secondi.
Trova la potenza SP10 che produce irradiazioni di 100 hertz. Regola di conseguenza la potenza SP10 dell'impulso di irradiazione. Esegui l'esperimento pseudo bidimensionale con il comando appropriato e imposta una serie di questi esperimenti pseudo 2D, variando i poteri di irradiazione SP10.
Dopo aver regolato tutti i parametri, esegui il codice per leggere gli spettri NMR, che integrano il segnale dell'acqua e lo salvano in una nuova variabile. Nel recupero per inversione del codice, si regola il percorso ai dati appropriati e si verifica la regione di integrazione dell'acqua. Poi regola il numero dell'esperimento contenente i dati di recupero per inversione.
Impostare tutti i parametri sperimentali e inserire i valori del pool vuoto dell'agarosio precedentemente ottenuti adattando il dataset dell'agarosio in modo simile. Esegui la prima sezione del codice condensato vuoto per ottenere l'adattamento al rilassamento longitudinale dell'acqua. Poi esegui la sezione condense empty del raccordo per avviare la figura in tempo reale che mostra la minimizzazione della funzione di fitting.
Esegui la sezione successiva del codice per determinare le incertezze e tracciare i dati. L'adattamento REDIFINE ha determinato i coefficienti di diffusione nelle fasi diluita e condensata, la popolazione di proteine nella fase condensata, la dimensione media delle goccioline e la permeabilità interfase per il campione del dominio terminale N del FUS. Il segnale NMR del dominio terminale N del FUS è rimasto rilevabile nella fase condensata.
Non è stata osservata alcuna differenza nel profilo di trasferimento di magnetizzazione tra il riferimento dell'agarosio e il dominio N-terminale FUS per campione fasico. Per i condensati di RNA ripetuti CAG, non viene osservato alcun segnale NMR. Di conseguenza, il profilo di trasferimento di magnetizzazione è significativamente diverso dal riferimento dell'agarosio.
L'esperimento CONDENSE-MT ha fornito la caratterizzazione dinamica dei condensati di RNA a espansione ripetuta. L'analisi CONDENSE-MT ha fornito la cinetica dello scambio protonico tra il condensato e l'acqua in massa. L'analisi CONDENSE-MT ha inoltre fornito il tempo di rilassamento trasversale dell'RNA nel condensato e il tasso apparente di rilassamento trasversale dell'acqua in massa.
In questo protocollo, possiamo caratterizzare la proprietà del condensato in uno stato biphasico senza la necessità di un tag chimico. Le gocce coesistono con un ambiente diluito, permettendo lo scambio tra le due fasi che imitano l'ambiente cellulare. I nostri metodi focalizzati sulla caratterizzazione del condensato possono essere integrati dai metodi convenzionali NMR per studiare le interazioni e le dinamiche della struttura molecolare tra le fasi.
In studi futuri, puntiamo a sviluppare modelli di condensati più complessi, adattando la metodologia a sistemi più complessi e, infine, studiare il condensato direttamente nei loro ambienti incellulari.
Overview
Biomolecular condensates formed via liquid–liquid phase separation (LLPS) play a crucial role in organizing the intracellular environment and regulating biochemical processes. Characterizing the composition, dynamics, and internal organization of these condensates is challenging, especially without external labeling. This article presents two complementary nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy methods that enable comprehensive, label-free analysis of biomolecular condensates in their native biphasic state.
Key Study Components
Area of Science
- Biochemistry
- Structural Biology
- Biophysics
Background
- Biomolecular condensates are formed through LLPS and are essential for cellular organization.
- Traditional methods for studying condensates often require external tags or labels.
- NMR spectroscopy offers a label-free approach to probe molecular motion and environmental heterogeneity.
- Understanding condensate properties is important for linking their structure to biological function and disease.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate NMR-based methods for characterizing biomolecular condensates without external tags.
- To quantify molecular partitioning, exchange dynamics, and internal organization of condensates.
- To provide a multidimensional, quantitative view of condensate structure and dynamics under near-native conditions.
Methods Used
- Diffusion-exchange NMR approach: REstricted DIffusion of INvisible speciEs (REDIFINE).
- Water-detected semi-solid magnetization-transfer NMR: CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT).
- Measurement of diffusion contrast, chemical exchange, and relaxation contrast.
- Analysis of molecular exchange rates, droplet size, interface permeability, hydration dynamics, and bound-water content.
Main Results
- REDIFINE quantifies the fraction of molecules partitioned between condensed and dilute phases.
- Determination of droplet size and interface permeability using diffusion and exchange measurements.
- CONDENSE-MT monitors condensates via bulk water protons, revealing partitioning and hydration dynamics.
- Both methods provide a comprehensive, label-free characterization of condensate structure and dynamics.
Conclusions
- The integration of REDIFINE and CONDENSE-MT expands the NMR toolbox for studying biomolecular phase separation.
- These methods enable quantitative, multidimensional analysis of condensates without the need for fluorescent or detection tags.
- This approach establishes a foundation for connecting condensate physicochemical properties with their biological functions and pathological misregulation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Label-free NMR characterization of biomolecular condensates addresses a critical gap in early discovery by enabling quantitative, multidimensional analysis of phase-separated assemblies under near-native conditions. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking, supporting informed portfolio decisions at key inflection points. Integrating these NMR methods into discovery workflows strengthens the link between condensate physicochemical properties and their biological or pathological roles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of condensate composition and molecular exchange without external tags.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying partitioning and exchange rates between phases.
- Improves predictive confidence in target selection by revealing condensate dynamics and organization.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing functional versus pathological condensate states.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of condensate structure and hydration for downstream assays.
- Supports assay standardization by delivering reproducible, label-free measurements.
- Enables screening of modulators affecting condensate dynamics or phase behavior.
- Facilitates platform reuse across diverse biomolecular systems exhibiting LLPS.
Translational & Preclinical Research
- Aligns condensate physicochemical properties with disease-relevant mechanisms when supported by LLPS pathology.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking condensate features across models.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, mechanistic biomarkers of condensate state.
- Delivers predictive de-risking for targets implicated in phase separation–related disorders.
Pipeline & Workflow Integration
These NMR methods position within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling robust characterization of condensate-driven mechanisms.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by quantifying molecular partitioning and exchange.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides diffusion, exchange, and hydration measurements to compare conditions and inform decisions.
- Translational Research: Connects condensate properties to disease mechanisms when LLPS is implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, label-free NMR platform for diverse condensate systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales label-free condensate analysis across R&D teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by de-risking biological mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of LLPS-relevant targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in solution NMR and phase separation biophysics.
- Demands access to high-field NMR instrumentation and analytical infrastructure.
- Benefits from cross-team standardization of sample preparation and data analysis.
- Adaptable to both dynamic and rigid condensate systems using complementary NMR methods.
- Limited to condensates amenable to NMR detection or water-proton monitoring as described.
