Estrazione del DNA a colonna a media velocità utilizzando rack a 24 pozzi
24 luglio 2026
Questo protocollo descrive un metodo conveniente per accelerare l'estrazione del DNA plasmidicale. Utilizzando rack personalizzati stampati in 3D compatibili con rotori standard a piastra a secchio oscillante, i ricercatori possono processare fino a 48 colonne di rotazione con tappi o fino a 116 colonne di rotazione senza condensatori simultaneamente, riducendo significativamente i tempi di manipolazione rispetto ai metodi manuali con microcentrifughe.
La nostra ricerca si concentra su piste stampate in 3D per l'estrazione parallela di DNA e RNA mediante colonnine di centrifugazione, creando un ponte tra metodi manuali e automatizzati. Questo approccio affronta i limiti dei metodi manuali con colonnine, che richiedono molto lavoro, consentendo l'elaborazione simultanea di fino a 116 campioni di DNA o RNA. Per iniziare, utilizzare una stampante 3D a fusione di filamento con un ugello da 0,4 millimetri per stampare il supporto.
Utilizzare un filamento in polilattide generico, o PLA, polietilene tereftalato glicole, o PETG, o acrilonitrile butadiene stirene, o ABS, con riempimento al 100%. Impostare l'altezza dello strato a 0,1 millimetro e attivare la levigatura della superficie. Regolare le impostazioni di stampa per garantire tenuta all'acqua e stabilità meccanica.
Verificare l'impermeabilità dei supporti prima del primo utilizzo. Riempire il serbatoio stampato con etanolo al 70% per testarlo prima dell'uso. Centrifugare per durate progressivamente crescenti per confermare l'assenza di perdite o danni strutturali.
Dopo aver effettuato con successo il test utilizzando la colla, unire i componenti del serbatoio di base per formare un'unità sigillata. Inoculare Escherichia coli, o trasformanti E. coli, in tre-cinque millilitri di brodo lisogenico, o mezzo LB, contenente antibiotici appropriati. Incubare la coltura per 12-16 ore a 37 gradi Celsius sotto agitazione.
Centrifugare a 2000 G per 10 minuti per raccogliere le cellule. Eliminare il soprannadante. Aggiungere 250 microlitri di tampone di risospensione al pellet.
Risospendere completamente il pellet mediante vortex o pipettaggio. Aggiungere 250 microlitri di buffer di lisi. Mescolare delicatamente capovolgendo il tubo da quattro a sei volte o oscillando la piastra a 24 pozzetti.
Aggiungere 350 microlitri di tampone di neutralizzazione e mescolare. Osservare la formazione di un precipitato bianco per confermare l'avvenuta neutralizzazione. Aggiungere il tampone di lisi in un tubo contenente polvere di biossido di titanio.
Aggiungere un rapporto volumetrico da due a uno tra volume e massa. Aggiungere 250 microlitri di sospensione di biossido di titanio al lisato e mescolare agitando il tubo.
Aggiungere 350 microlitri di tampone di neutralizzazione e mescolare accuratamente. Centrifugare a 2000 G per 10 minuti. Osservare il pellet cellulare completamente precipitato in presenza di biossido di titanio e il sopranatante completamente trasparente.
In assenza di biossido di titanio, osservare la presenza di sedimenti residui nel soprannatante. Raccogliere il soprannatante senza disturbare il precipitato e trasferirlo sulla colonna di legame. Posizionare le colonne di legame del DNA nel supporto a strati del rack.
Posizionare i tappi delle colonne negli appositi alloggiamenti per fissarli durante la centrifugazione. Inserire le colonne di chiarifica o filtrazione nel livello superiore sopra le colonne di legame. Trasferire il lisato neutralizzato preparato nelle colonne di filtrazione.
Posizionare il rack assemblato in un rotore a secchielli oscillanti. Centrifugare a 2000 G per un minuto a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il rack dalla centrifuga, rimuovere e scartare lo strato della colonna filtrante.
Scartare il flusso in eccesso dal serbatoio in un contenitore per rifiuti. Riassemblare il supporto con le colonne di legame. Aggiungere da 500 a 700 microlitri di tampone di lavaggio a ciascuna colonna di legame.
Centrifugare a 2000 G per un minuto. Scartare il flusso passato dal serbatoio e ripetere il passaggio di lavaggio come precedentemente dimostrato. Rimuovere le colonne di legame dal rack e trasferirle in provette di raccolta da due millilitri.
Centrifugare a 10.000 G o superiore per un minuto per asciugare la membrana. Trasferire le colonne in provette pulite da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione o acqua direttamente sulla membrana e incubare le colonne per un minuto a temperatura ambiente.
Centrifugare a 10.000 G o superiore per un minuto per eluire il DNA. Il rendimento totale di plasmide non ha mostrato differenze significative tra il metodo convenzionale e l'estrazione utilizzando le configurazioni del portaprovette. La conferma del plasmide è stata preservata con distribuzioni simili di forme rilassate, lineari e a superelica.
La distribuzione del colorante era limitata all'area di scarico direttamente al di sotto delle colonne caricate, senza segnale visibile nei pozzetti adiacenti o sulle punte delle colonne vicine, indicando che il design del rack riduce la probabilità di schizzi e di trasferimento tra colonne. L'amplificazione è stata rilevata solo negli eluiti provenienti dalle colonne alle quali era stato aggiunto l'amplicone. Questa particella consente ai ricercatori di ottenere DNA plasmidico di alta qualità per applicazioni successive, tra cui clonaggio, sequenziamento e analisi PCR.
La considerazione più importante durante l'esecuzione di questo protocollo è prevenire la contaminazione incrociata mantenendo un serbatoio stagno, senza sovrapposizioni, stampato in 3D. Inoltre, seguendo questa procedura, questi supporti possono essere utilizzati per qualsiasi analisi di estrazione di acidi nucleici basata su colonne.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo semiautomatico e scalabile per l'estrazione di DNA ad alto rendimento mediante colonnine spin a membrana di silice. Sfruttando supporti personalizzati stampati in 3D, compatibili con i normali rotori per centrifuga a piastre, l'approccio consente un'elaborazione parallela efficiente di grandi lotti di campioni, offrendo un'alternativa economica ai costosi sistemi automatizzati di gestione dei liquidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Genomica
- Automazione del laboratorio
Sfondo
- L'estrazione con colonnina a membrana in silice è ampiamente utilizzata per la purificazione del DNA ad alta qualità.
- La lavorazione manuale è laboriosa e difficile da scalare per un elevato numero di campioni.
- I robot automatici per la movimentazione dei liquidi sono spesso proibitivamente costosi per i laboratori più piccoli.
- Esiste la necessità di soluzioni accessibili e scalabili per l'estrazione del DNA.
Scopo dello studio
- Sviluppare un flusso di lavoro semplificato ed semi-automatizzato per l'estrazione del DNA.
- Progettare supporti stampati in 3D che consentano l'elaborazione ad alta produttività mediante attrezzature di laboratorio standard.
- Colmare il divario tra le minipreparazioni manuali e l'automazione costosa.
Metodi Utilizzati
- Porta-colonne personalizzati, stampati in 3D.
- Elaborazione in parallelo di fino a 116 colonne di centrifugazione commerciali.
- Configurazione nidificata per la chiarificazione simultanea del lisato e il legame del DNA in un unico passaggio di centrifugazione.
- Reservoir condiviso per semplificare i passaggi di lavaggio e la gestione dei rifiuti.
Risultati principali
- Il rendimento e la purezza del DNA sono paragonabili a quelli ottenuti con protocolli manuali standard.
- Il tempo totale di lavorazione è ridotto del 50–70% per lotti superiori a 24 campioni.
- Il tempo di lavorazione per filtrazione, lavaggi e smaltimento degli scarti è ridotto di 5–10 minuti, indipendentemente dalla dimensione del lotto.
- Il sistema è open-source ed economico, adatto a laboratori di piccole e medie dimensioni.
Conclusioni
- Il sistema semi-automatico aumenta in modo significativo la produttività e l'efficienza nell'estrazione del DNA.
- Offre un'alternativa pratica ed economica all'automazione completa per molti laboratori.
- Questo approccio democratizza l'accesso alla tecnologia di purificazione del DNA ad alta produttività.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'estrazione efficiente e scalabile del DNA rappresenta un collo di bottiglia fondamentale nei flussi di lavoro di scoperta e screening di farmaci guidati dalla genomica. Questo sistema semi-automatico a media produttività permette la purificazione di acidi nucleici di alta qualità a una frazione del costo e della manodopera richiesti dall'automazione completa, sostenendo direttamente i team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici che intendono aumentare il numero di campioni analizzati senza investimenti iniziali significativi. L'approccio colma il divario tra le estrazioni manuali su piccola scala e i sistemi robotici costosi, migliorando la flessibilità operativa e l'allocazione delle risorse all'interno dei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un'estrazione rapida e parallela del DNA per supportare studi di screening genetico e identificazione di bersagli.
- Facilita l'elaborazione di campioni ad alto rendimento per analisi di percorsi metabolici e studi meccanicistici.
- Migliora la coerenza dei campioni, riducendo la variabilità nei saggi molecolari successivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara DNA di alta qualità per lo sviluppo di saggi, il genotipaggio e le piattaforme di screening molecolare.
- Permette la standardizzazione e la riproducibilità riducendo al minimo i passaggi di manipolazione manuale.
- Si adatta in modo efficiente alla lavorazione in batch, consentendo lo screening robusto di librerie di composti o genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce un'estrazione affidabile del DNA per studi di scoperta e validazione di biomarcatori.
- Mantiene l'integrità del campione per la ricerca traslazionale che richiede una qualità costante degli acidi nucleici.
- Permette la continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, supportando set di campioni più ampi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema di estrazione semi-automatico si inserisce tra le fasi iniziali della scoperta e i flussi di lavoro preclinici, consentendo una transizione senza soluzione di continuità da studi guidati da ipotesi a screening ad alto rendimento e ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e l'analisi dei percorsi metabolici consentendo un'estrazione efficiente del DNA da diversi insiemi di campioni.
- Screening: Fornisce rese quantitative e riproducibili di DNA adatte a saggi molecolari successivi e piattaforme di screening.
- Analisi: Garantisce un input costante di acidi nucleici per analisi comparative e valutazioni statistiche delle condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si allinea a studi su biomarcatori e preclinici che richiedono una preparazione del DNA di alta qualità e scalabile.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma open-source e adattabile per un uso ripetuto in diversi programmi di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva garantendo la qualità e la coerenza del DNA tra diversi esperimenti.
- Valore operativo: Riduce del 50–70% il lavoro manuale e il tempo di elaborazione per grandi lotti, migliorando l'efficienza del laboratorio.
- Valore strategico: Permette una scalabilità economicamente vantaggiosa dei flussi di lavoro genomici senza richiedere ingenti investimenti iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per rischio consentendo l'elaborazione di campioni ad alto rendimento e riproducibile per progetti multipli.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze di base in biologia molecolare e familiarità con i protocolli per colonne di centrifugazione.
- Necessita dell'accesso a rotori per piastra da centrifuga standard e componenti per supporti stampati in 3D.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire un funzionamento coerente e una qualità costante dei dati.
- Adattabile a diversi tipi di campioni e a esigenze variabili di throughput, entro i limiti della capacità della centrifuga.
- Dipende dalla disponibilità di hardware open source e dalle capacità di fabbricazione locale.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of 3D-Printed Equipment
1:34
Preparation of Bacterial Culture and Cell Lysate
2:43
Preparation of Lysate Using Titanium Dioxide Co-Precipitation
3:41
Assembly of the Filtration Unit for Lysate Clearance and DNA Binding
4:27
Washing and Elution of DNA
5:32
Results
6:22
Conclusion
