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	<li>Roth, T. L., Puig-Saus, C., Yu, R., Shifrut, E., Carnevale, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting.">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 285-297 (2018).</li><li>Li, L. H., McCarthy, P., Hui, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+electrotransfection+of+human+primary+hematopoietic+stem+cells.">High-efficiency electrotransfection of human primary hematopoietic stem cells.</a> FASEB J. 15 (1), 159-167 (2001).</li><li>Parnas, O., Jovanovic, M., Eisenhaure, T. M., Herbst, R. H., Dixit, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+screen+in+primary+immune+cells+to+dissect+regulatory+networks.">A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks.</a> Cell. 162 (3), 675-686 (2015).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li><li>Pollack, M. G., Fair, R. B., Shenderov, A. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrowetting-based+actuation+of+liquid+droplets+for+microfluidic+applications.">Electrowetting-based actuation of liquid droplets for microfluidic applications.</a> Appl Phys Lett. 77 (11), 1725-1726 (2000).</li><li>Sinha, H., Quach, A. B. V., Vo, P. Q. N., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+gene-editing+platform+for+deciphering+cancer+genes.">An automated microfluidic gene-editing platform for deciphering cancer genes.</a> Lab Chip. 18 (21), 3291-3301 (2018).</li><li>Little, S. R., Rizzetto, S., Sherwood, C. A., Quach, A. B. V., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tri-droplet+liquid+structure+for+highly+efficient+intracellular+delivery+in+primary+mammalian+cells+using+digital+microfluidics.">A tri-droplet liquid structure for highly efficient intracellular delivery in primary mammalian cells using digital microfluidics.</a> Adv Mater Technol. 8 (11), 2300719 (2023).</li><li>Little, S. R., Vo, P. Q. N., Sinha, H., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+microfluidic+platform+for+the+microscale+production+of+functional+immune+cell+therapies.">A digital microfluidic platform for the microscale production of functional immune cell therapies.</a> Anal Chem. 97 (21), 11026-11034 (2025).</li><li>Patel, M. A., Boribong, B. P., Sinha, H., Xiao, B., Xie, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+scalable+arrayed+CRISPR+screening+in+primary+cells+enables+discovery+at+the+single+donor+resolution.">Miniaturized scalable arrayed CRISPR screening in primary cells enables discovery at the single donor resolution.</a> Sci Rep. 15, 29350 (2025).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nguyen, D. N., Roth, T. L., Li, P. J., Chen, P. A., Apathy, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency.">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette</td><td>Integra</td><td>4732</td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td>Flow Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface</td><td>Thermo Fisher</td><td>174927</td><td>Protocollo sferi</td></tr><tr><td>96-well conical-bottom plate&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td>Protocollo sferi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>357421</td><td>1 in 200, Clone A161A1</td></tr><tr><td>Attune Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>10564011</td><td>Media Supplement- Coltura sferi</td></tr><tr><td>DMF compatible buffer</td><td>DropGenie</td><td></td><td>Trasfezione</td></tr><tr><td>DropGenie Transfection System</td><td>DropGenie</td><td></td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>Echo&nbsp;Acoustic Dispenser 650 Series</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo&nbsp;Qualified 384-well Low Dead Volume</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Flow Buffer</td></tr><tr><td>EGFP mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7201</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluorescent Microscope</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Media Supplement- Coltura sferi</td></tr><tr><td>Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector</td><td>Fida Biosystems ApS</td><td></td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510</td><td>Cytek Biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>Protocollo sferi</td></tr><tr><td>Human IL-2 Recombinant Protein,</td><td>Peprotech</td><td>200-02 50ug</td><td>Supplemento media per cellule T</td></tr><tr><td>Human Primary Pan CD3+ T Cells</td><td>All Cells</td><td></td><td>Sangue periferico, crioconservato, cellule T Helper pan CD3+, negativamente selezionate</td></tr><tr><td>Immunocult CD3/CD28 Activator</td><td>StemCell Technologies</td><td>10970</td><td>Media per l'attivazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Immunocult Expansion Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>10981</td><td>Media per l'attivazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Incucyte Live Cell Analysis System</td><td>Sartorius</td><td></td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot</td><td>Integra</td><td>4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),&nbsp;</td><td>Strumentazione</td></tr><tr><td>non targeting synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5&rsquo; GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-202</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human TCR &alpha;/&beta; Recombinant Antibody</td><td>Biolegend</td><td>380805</td><td>1 in 200, Clone QA20B12&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Anti-Human CD8</td><td>BD Pharmingen</td><td>557750</td><td>1 in 200, Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Media Supplement- Coltura sferi</td></tr><tr><td>Poly-L-glutamic Acid (PGA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4761-100MG</td><td>Usare a 100mg/ml</td></tr><tr><td>Prism version 8.0.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease</td><td>IDT</td><td>10017687</td><td></td></tr><tr><td>Spheroid Microplate</td><td>Corning</td><td>3830</td><td>Protocollo sferi</td></tr><tr><td>Surfactant F</td><td>DropGenie</td><td></td><td>Trasfezione- usare a 1:20 nel buffer DMF compatibile per preparare il buffer di trasfezione completo</td></tr><tr><td>TRAC synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5&rsquo; AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>Protocollo sferi</td></tr></tbody></table>

una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma crispr a basso input e la trasfezione di mrna in cellule t in sospensione e modelli di celle 3d

A Digital Microfluidic Electroporation Platform for Low-Input CRISPR Genome Editing and mRNA Transfection In Suspension T Cells and 3D Cell Models

Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

Digital microfluidic (DMF) electroporation enables precise, low-volume genetic manipulation of mammalian cells while minimizing cellular input by up to ...

Our research develops automated digital microfluidic platforms for efficient low input transfection and CRISPR gene editing. Standard electrocuration requires millions of cells. This platform achieves efficient editing with only 10, 000 cells per condition.To begin, obtain a T75 flask from the incubator containing CD3 positive human primary T cells. In the tissue culture hood, transfer the cells to a 15 milliliter falcon tube and centrifuge at a relative centrifugal force of 200 for five minutes. Discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of fresh medium.Pipette 10 microliters of cell suspension into a counter cell counting chamber. Using an automated cell counter, determine the cell concentration and viability. Pipette 100, 000 cells into four to five wells of a V-bottom well plate and place on ice.Reconstitute one lyophilized track knockout targeting single guide RNA or other sgRNA and one lyophilized non-targeting control, or NTC sgRNA, in nucleus free water to a stock concentration of 100 micromolar. After preparing a 100 milligram per milliliter stock solution of polyL-glutamic acid, or PGA, in nucleus free water in two tubes, label the tubes as, tra

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Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

Abbiamo sviluppato una coltura cellulare automatizzata e piattaforma di interrogatorio per esperimenti di stimolazione cellulare micro-scala. La piattaforma offre un controllo semplice, versatile e preciso nel coltivare e stimolare le piccole popolazioni di cellule, e recuperando lisati per le analisi molecolari. La piattaforma è adatto a studi che impiegano cellule preziosi e / o reagenti.

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l'efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.

Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

L'elettroporazione di nuova generazione è un metodo efficiente per trasfettare cellule Th17 umane con piccoli RNA per alterare l'espressione genica e il comportamento cellulare.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Questo protocollo utilizza reporter fluorescenti e ordinamento cellulare per semplificare gli esperimenti knock-in in macrofagi e linee cellulari T. Per questi esperimenti di knock-in semplificati vengono utilizzati due plasmidi, vale a dire un plasmide che esprime CRISPR / Cas9 e DsRed2 e un plasmide donatore di ricombinazione omologa che esprime EBFP2, che è permanentemente integrato nel locus Rosa26 nelle cellule immunitarie.

Gene Knock-in di CRISPR/Cas9 e smistamento cellulare in macrofagi e linee cellulari T

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Il protocollo descrive i metodi per l'editing dell'epigenoma basato su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in linee cellulari umane utilizzando la trasfezione del DNA plasmidico e la nucleofecazione dell'mRNA.

Editing dell'epigenoma CRISPR nelle cellule umane mediante trasfezione del DNA plasmidico e consegna della nucleofecazione dell'mRNA

Questo protocollo utilizza la modellazione computazionale per quantificare le soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili utilizzando la distribuzione spaziale delle cellule trasfettate all'interno di un imitatore tissutale tridimensionale per l'analisi ad alto rendimento dei protocolli di elettroporazione.

Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

DropGenie.  Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

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