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<ol>
	<li>Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+skin+and+intrinsic+aging:+biological,+environmental,+and+therapeutic+insight.">Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight.</a> J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).</li><li>Dorf, N., Maciejczyk, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+senescence-from+basic+research+to+clinical+practice.">Skin senescence-from basic research to clinical practice.</a> Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).</li><li>Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+cigarette+smoke+and+solar+rays+causes+effects+similar+to+skin+aging+in+a+bilayer+skin+model.">The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model.</a> Sci Rep. 13, 17969 (2023).</li><li>Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+collagen+production+in+chronologically+aged+skin:+roles+of+age-dependent+alteration+in+fibroblast+function+and+defective+mechanical+stimulation.">Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation.</a> Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).</li><li>Zhang, S., Duan, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+against+skin+aging:+the+way+from+bench+to+bedside.">Fighting against skin aging: the way from bench to bedside.</a> Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).</li><li>Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antioxidants+in+skin+aging+and+the+molecular+mechanism+of+ROS:+a+comprehensive+review.">Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review.</a> Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).</li><li>Addor, F. A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photoaging:+additional+factors+involved+in+the+process+of+skin+aging.">Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging.</a> Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).</li><li>Mucha, M., Skrzydlewska, E., GÄ™gotek, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+protection+against+oxidative+stress+in+human+skin+melanocytes.">Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes.</a> Commun Biol. 8, 1283 (2025).</li><li>Hughes, B. K., Bishop, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+role+of+senescent+melanocytes+in+skin+ageing.">Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing.</a> Biomedicines. 10, 3111 (2022).</li><li>Kami&#324;ski, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+melanogenesis+and+melanoma+development.">Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development.</a> Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).</li><li>Jim&#233;nez-Cervantes, C., Mart&#237;nez-Esparza, M., P&#233;rez, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanogenesis+in+response+to+oxidative+stress:+transient+downregulation+of+melanocyte+differentiation+markers+and+possible+involvement+of+microphthalmia+transcription+factor.">Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor.</a> J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).</li><li>Da&#324;czak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Pola&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+skin-related+research:+targeted+signaling+pathways+and+naturally+occurring+therapeutic+agents.">Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents.</a> Aging Cell. 22, e13845 (2023).</li><li>Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dangerous+liaisons:+loss+of+keratinocyte+control+over+melanocytes+in+melanomagenesis.">Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis.</a> Bioessays. 46, e2400135 (2024).</li><li>Ali, L., Al Niaimi, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+melasma+explained.">Pathogenesis of melasma explained.</a> Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).</li><li>Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+the+evidence+that+cellular+senescence+causes+skin+ageing.">How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing.</a> Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).</li><li>Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cellular+senescence+in+skin+aging+and+age-related+skin+pathologies.">The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies.</a> Front Physiol. 14, 1297637 (2023).</li><li>Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+senescence-associated+phenotype+in+human+skin+fibroblasts.">Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts.</a> Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).</li><li>Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellular+senescence+in+human+primary+melanocytes+and+malignant+melanoma+cells+in+vitro.">Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro.</a> Cells. 11, 1489 (2022).</li><li>Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+face+skin+melanocytes+for+the+study+of+hyperpigmentation.">Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation.</a> Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).</li><li>Ku&#269;era, O., Endlicher, R., Rou&#353;ar, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tert-butyl+hydroperoxide-induced+oxidative+stress+on+lean+and+steatotic+rat+hepatocytes+in+vitro.">The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro.</a> Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).</li><li>Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBHP+treatment+as+a+model+for+cellular+senescence+and+pollution-induced+skin+aging.">tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).</li><li>Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+oxidative+stress+upregulates+drusen-related+protein+expression+in+adult+human+RPE+stem+cell-derived+RPE+cells:+a+novel+culture+model+for+dry+AMD.">Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD.</a> Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).</li><li>Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+make+human+skin+models+based+on+cellular+senescence+for+ageing+research.">Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research.</a> Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease.">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142, 620-632 (2015).</li><li>Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transfection+of+melanocytes.">Isolation, culture, and transfection of melanocytes.</a> Curr Protoc. 3, e774 (2023).</li><li>Martic, I., Wedel, S., Jansen-DÃ¼rr, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+to+investigate+UVB-induced+cellular+senescence+and+pigmentation+in+melanocytes.">A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).</li><li>Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+human+melanocytes+drive+skin+ageing+via+paracrine+telomere+dysfunction.">Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction.</a> EMBO J. 38, e101982 (2019).</li><li>Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+response+and+Nrf2+signaling+in+aging.">Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging.</a> Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).</li><li>Birch, J., Gil, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+SASP:+many+therapeutic+avenues.">Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.</a> Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).</li><li>Kang, H. Y., Ortonne, J. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+should+be+considered+in+treatment+of+melasma.">What should be considered in treatment of melasma.</a> Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+cell+senescence,+and+novel+molecular+mechanisms+in+aging+and+age-related+diseases.">ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+company:+microenvironmentally+mediated+resistance+to+targeted+therapy+in+melanoma.">Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).</li><li>L&#243;pez-Ot&#237;n, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153, 1194-1217 (2013).</li><li>Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+melanogenesis.">Mechanisms regulating melanogenesis.</a> An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).</li><li>Ratz-&#321;yko, A., Arct, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+as+an+active+ingredient+for+cosmetic+and+dermatological+applications:+a+review.">Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review.</a> J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).</li><li>Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age.">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).</li><li>Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+senescent+cell+clearance+alleviates+age-related+brain+inflammation+and+cognitive+impairment+in+mice.">Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice.</a> Aging Cell. 20, e13296 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+transcriptional+heterogeneity+in+senescent+cells.">Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells.</a> Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m membrane filter</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 M citric acid&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>K91567844</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Merck</td><td>A649033</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>K56036736</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Lab Honeywell</td><td>30620</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>CarlRoth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>5 M Sodium Chloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma</td><td>B9146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Costar CellLifter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for cell culture/microscopy</td><td>Epredia</td><td>CB00200RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife Basal Medium</td><td>CellSystems</td><td>LM-0004</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife M Melanocyte Kit&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS-1041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Human neonatal melanocytes</td><td>CellSystems</td><td>FC-0023</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1 antibody (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td>Dilution 1:1000 in 5% BSA</td></tr><tr><td>Mounting medium containing DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gradient gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A38904-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanide</td><td>Sigma</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>pRB antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>93085</td><td>Dilution 1:1000 in 5% BSA</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>self prepared</td><td>N/A</td><td>500 mM NaF; 2 &micro;g/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate</td></tr><tr><td>RIPA buffer&nbsp;</td><td>self prepared</td><td>N/A</td><td>containing: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen</td><td>1015762</td><td>Included in RNeasy Mini Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (for 0.1% solution)</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (for 0.3% solution)</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>CarlRoth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;H2AX antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>2577S</td><td>Dilution 1:200&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un protocollo standardizzato per l'indotta della senescenza prematura indotta dallo stress nei melanociti umani primari utilizzando idroperossido di tert-butil

A Standardized Protocol for Inducing Stress-Induced Premature Senescence in Primary Human Melanocytes Using Tert-butyl Hydroperoxide

Un protocollo standardizzato per l'indotta della senescenza prematura indotta dallo stress nei melanociti umani primari utilizzando idroperossido di tert-butil

Environmental stressors, including UV radiation, air pollution, or cigarette smoke, drive extrinsic skin aging. Exposure to these extrinsic aging factors ...

La nostra ricerca si concentra sull'indagine del fenotipo di senescenza dei melanociti e del suo contributo all'invecchiamento cutaneo estrinseco. I modelli di senescenza esistenti utilizzano fibroblasti e non riescono a catturare la biologia specifica dei melanociti. Questo protocollo induce uno stress ossidativo mediato da tBHP in melanociti umani primari.Per iniziare, procurarsi i reagenti necessari. Dopo aver scongelato i melanociti e averli lasciati ripristinare per tre giorni, assicurarsi che le cellule raggiungano una confluenza dell'80-90% nel giorno di semina. Aspirare il mezzo dal matraccio. Lavare le cellule due volte con DPBS. Aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina EDTA per staccare le cellule. Collocare il matraccio nell'incubatrice per cinque minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Battere leggermente il matraccio. Osservare le cellule al microscopio per confermare il distacco completo. Aggiungere un volume pari a 1,5 volte quello dell'inibitore della tripsina per arrestare la reazione.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Diluire la sospensione con DPBS fino a un volume finale di 10 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a una forza centrifuga relativa di 100 per cinque minuti.Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo al volume desiderato. Seminare 600.000 cellule per piastra da 10 centimetri per le piastre trattate con idroperossido di tert-butilo, o tBHP. Seminare 400.000 cellule per piastra per le piastre di controllo.Preparare una soluzione lavorativa di 10 millimolari a partire dal stock di tBHP utilizzando DPBS o mezzo di coltura. Aggiungere tBHP alle cellule alla concentrazione di 100 micromolari per un'ora per ogni trattamento. Muovere la piastra avanti e indietro per distribuire il tBHP in modo uniforme in tutto il mezzo.Collocare le cellule nell'incubatore esattamente per un'ora a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Aspirare il mezzo per interrompere il trattamento con tBHP. Lavare le piastre due volte con DPBS preriscaldato a 37 gradi Celsius.Aggiungere il volume appropriato di mezzo fresco alle piastre. Posizionare le piastre nell'incubatrice e lasciare che le cellule si riprendano per almeno quattro ore prima del trattamento successivo. Ripetere la procedura di trattamento più tardi nella stessa giornata per il secondo trattamento.Continuare il regime di trattamento fino al giorno quattro, quindi mantenere le cellule in coltura fino al giorno nove per valutare i marcatori di senescenza. Contare le cellule trattate con tBHP e le cellule di controllo. Riseminare le cellule alla stessa densità iniziale oppure, se si ottengono meno di 600.000 cellule dalle piastre trattate con tBHP, riseminare tutte le cellule raccolte.Contare le cellule ai giorni quattro, nove e quindici della coltura. Al giorno nove, lavare le cellule due volte con PBS. Fissare le cellule utilizzando formaldeide al 2% e glutaraldeide allo 0,4%.Lavare le cellule fissate due volte con PBS. Incubare le cellule fissate in una soluzione di colorazione a pH 6. Coprire la piastra per proteggerla dalla luce, quindi incubare per 18 ore a 37 gradi Celsius in assenza di anidride carbonica.Lavare le cellule due volte con PBS. Utilizzando la microscopia ottica, acquisire un'immagine e contare il numero di cellule colorate di blu. Dividere questo valore per il numero totale di cellule all'interno dello stesso campo.Esprimere i risultati come percentuale di cellule positive. Dopo l'induzione dello stress ossidativo, il trattamento con tBHP ha ridotto in modo significativo la proliferazione dei melanociti rispetto ai controlli. Le cellule trattate hanno raggiunto solo 1,4 raddoppiamenti cumulativi della popolazione, o cPDL, entro il nono giorno, mentre i controlli hanno raggiunto 3,1 cPDL.Al giorno 15, le cellule trattate hanno raggiunto un plateau a 1,9 cPDL, mentre le cellule di controllo si sono espanse fino a 5,1 cPDL. I melanociti trattati con tBHP hanno mostrato un aumento dell'area superficiale cellulare rispetto ai controlli in tutti i punti temporali misurati, con un ingrandimento progressivo fino al giorno 15, coerente con la morfologia ingrandita e appiattita delle cellule senescenti. I melanociti trattati con tBHP hanno mostrato un aumento dell'attività della beta-galattosidasi associata alla senescenza, o attività della SA-beta-galattosidasi, con il 32% di cellule positive rispetto al 3% nei controlli.L'aumento della positività alla SA-beta-galattosidasi era coerente con un fenotipo senescente. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato livelli aumentati di gamma-H2AX nei melanociti trattati con tBHP rispetto ai controlli. Le cellule trattate hanno mostrato un segnale di gamma-H2AX più intenso rispetto ai controlli.L'analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale ha dimostrato un aumento dell'espressione dei fattori del fenotipo secretorio associato alla senescenza, con l'interleuchina-8 che ha mostrato l'aumento maggiore, mentre l'interleuchina-6 e la metalloproteina della matrice-1 hanno mostrato aumenti moderati. L'analisi mediante Western blot ha confermato l'induzione della senescenza.La laminina B1 ha mostrato una riduzione significativa nei melanociti trattati con tBHP rispetto ai controlli. I livelli della proteina retinoblastoma fosforilata sono risultati ridotti nei melanociti trattati con tBHP rispetto ai controlli. Il trattamento con tBHP ha aumentato l'espressione trascrizionale di p16 e p21 nei melanociti.Questo modello consente ai ricercatori di studiare come i melanociti senescenti influenzino la pigmentazione e comunichino con le cellule circostanti attraverso i fattori infiammatori SASP. La difficoltà di questo protocollo risiede nella precisione dei tempi. Il tBHP deve essere applicato due volte al giorno con un intervallo di almeno quattro ore.Seguendo questo protocollo, la senescenza può essere caratterizzata mediante colorazione per la beta-galattosidasi associata alla senescenza, immunofluorescenza, RT-qPCR e Western blotting di marcatori di senescenza consolidati.

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