Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

In questo lavoro, studiamo come le proprietà fisiche ed elettriche delle membrane lipidiche e del loro ambiente influenzino la conduzione ionica nei sistemi modello bilayer con interfaccia a gocce. L'elettrofisiologia tradizionale a patch clamp non approfondisce la biofisica delle membrane su scala più ampia, ma questa singola piattaforma cattura sia l'attività a canale singolo sia le aree di membrana di dimensioni maggiori su scala millimetrica per studiare in modo più approfondito la biofisica delle membrane. Per cominciare, preparare gli elettrodi di filo d'argento rivestiti di agarosio clorato e le soluzioni di vescicole lipidiche per esperimenti elettrofisiologici.

Per la formazione di bilayer di interfaccia a gocce, si posiziona una piastra di Petri trasparente sul fondo del microscopio invertito. Riempi la ciotola con olio di alcano, come il 100% esadecano, fino a una profondità di circa cinque millimetri. Dopo aver fissato gli elettrodi alla testa del patch clamp e al supporto per elettrodi a terra, si utilizza i comandi del micromanipolatore per abbassare entrambe le estremità sferiche rivestite di agarosio nell'olio fino a una profondità di circa 2,5 millimetri sotto la superficie dell'olio, evitando movimenti rapidi per evitare collisioni con la piastra di Petri.

Regola la messa a fuoco del microscopio finché entrambe le estremità della sfera e i loro rivestimenti in agarosio sono nitidamente a fuoco. Posizionare gli elettrodi vicino al bordo del campo visivo, in modo che entrambi possano essere osservati simultaneamente. Utilizzando una pipetta calibrata da due microlitri, aspira le vescicole lipidiche DPhPC estruse, dopate con gramicidina A. Eroga lentamente 250 nanolitri della sospensione direttamente su ciascuna estremità sferica coperta di agarosio usando una punta di pipetta separata per ciascuna senza toccare il guscio d'agarosio.

Lascia che le gocce si diffondano sulla superficie dell'agarosio e si abbassino visibilmente verso il basso a causa della gravità e della riduzione della tensione superficiale, formando una forma di goccia pendente. Osserva l'abbassamento laterale attraverso la parete della piastra di Petri se è libero. Dopo cinque minuti, spingi delicatamente il tavolo antivibrazione per valutare la goccia.

Confermare che le gocce che si abbassano si muovono con un leggero ritardo rispetto al movimento degli elettrodi, indicando la formazione di gocce monostrato lipidici completamente rivestite. Se questo comportamento non viene osservato, attendi altri due o tre minuti e ripeti la valutazione. Assicurati che il microscopio, il tavolo antivibrazione, la gabbia di Faraday, l'amplificatore, il digitalizzatore, il generatore di funzioni e il computer siano collegati a una messa a terra comune.

Organizza le connessioni degli strumenti secondo la guida di configurazione del produttore e configura l'installazione elettrica e ottica essenziale, seguendo le istruzioni dettagliate per gli esperimenti bilayer con interfaccia a goccia. Configura un generatore di funzioni esterno o il canale di uscita software di acquisizione per generare una forma d'onda di tensione triangolare da 10 Hertz e 10 millivolt. Conferma ampiezza e frequenza su un oscilloscopio collegato e nel software di acquisizione.

Dopo che le gocce si sono rilassate per circa 10 minuti, usa i micromanipolatori per portare le due gocce a un contatto delicato. Attiva la forma d'onda triangolare a 10 Hertz e 10 millivolt e monitora la risposta capacitiva alla corrente nel software di acquisizione. Regolare l'area di contatto delle gocce spostando leggermente gli elettrodi finché la risposta della corrente capacitiva picco a picco alla forma d'onda è compresa tra circa 100 e 200 picoampere.

Oppure l'area di contatto non supera circa 1/4 del diametro della goccia. Aspettare la formazione spontanea di due strato indicata elettricamente da una risposta di corrente capacitiva picco a picco in espansione e otticamente da una riflessione interna crescente con un aspetto ovale nella regione di contatto. Confermare che i bilayer lipidici puri mostrano altipiani di corrente rettangolari in risposta allo stimolo di tensione triangolare, mentre i bilayer dopati con gramicidina A mostrano altipiani inclinati, riflettendo una conduzione ionica d'ensemble.

Una volta confermate risposte stabili-capacitive o conduttive, si disattiva la forma d'onda triangolare e si lascia bilanciare il bistrato di interfaccia a gocce per almeno 15 minuti prima di applicare i protocolli di stimolazione. Nel software di cattura video, imposta il frame rate ad almeno 20 fotogrammi al secondo. Seleziona le impostazioni appropriate della fotocamera e dell'obiettivo obiettivo.

Successivamente, clicca su Acquisisci e seleziona Nuovo protocollo. Nella scheda Modalità Acquisizione, seleziona Stimolazione Episodica. Imposta le corse per ogni prova e le sweep per corsa a uno.

Regolare la durata dello sweep a quattro secondi in più rispetto alla durata totale dell'esperimento, permettendo una base di due secondi pre e dopo lo stimolo. Imposta la frequenza di campionamento tra cinque e dieci kilohertz. Nella scheda Input, assegna il canale di registrazione all'ingresso corrente.

E poi, nella scheda Outputs, assegna il canale di stimolazione all'uscita di tensione che controlla gli elettrodi. Apri la scheda Forma d'Onda. Nella colonna A, imposta il tipo a Passo, il primo livello e il livello delta a zero millivolt, e la prima durata a 2.000 millisecondi per definire una base pre-stimolazione.

Nella colonna B, imposta il tipo Pulse per facilitare l'impulso accoppiato. Specificare i valori per la prima durata e l'ampiezza di tensione di primo livello e impostare la velocità di treno per definire l'intervallo di interimpulsi corrispondente al ciclo di lavoro target. Regola la larghezza dell'impulso a 100 millisecondi.

Nella colonna C, per la depressione di impulsi accoppiati, imposta il tipo su Impulso con la stessa ampiezza e durata dell'impulso. Imposta la velocità di treno per ottenere il ciclo di lavoro più basso desiderato e imposta la larghezza dell'impulso. Successivamente, nella colonna D, configurare i parametri post-stimolazione identici alla base pre-stimolazione.

Rivedi il protocollo e salvalo con un nome descrittivo. Inizia la registrazione video e avvia immediatamente l'acquisizione elettrica e la stimolazione cliccando sul pulsante Registra in ogni software. Durante i primi 60 secondi di stimolazione, osserva che la corrente aumenta e può raggiungere un plateau.

Negli ultimi 60 secondi, osserva che la corrente diminuisce. Alla fine del protocollo, interrompere contemporaneamente l'acquisizione elettrica e la registrazione video. Infine, effettua un post-processing per estrarre l'area della membrana e calcolare la corrente, l'area e il flusso normalizzati da dati di imaging ed elettrici.

Immagini sequenziali hanno catturato uno spostamento spontaneo di zippi a doppio strato e l'espansione dell'area quando due gocce che si afflosciavano si sono contatte. Le riflessioni ovali interne luminose al contatto delle gocce venivano utilizzate per stimare nel tempo il diametro dei due strati e l'area della membrana. La facilitazione degli impulsi abbinati da zero a 60 secondi e la depressione degli impulsi da 60 secondi a 120 secondi venivano erogati utilizzando impulsi da 100 millisecondi.

Le risposte rappresentative del ciclo durante i periodi on e i modelli di stimolazione sono state registrate. La corrente normalizzata per i due strati DPhPC dopati con gramocidina A negli oli esadecanano e dodecano/esadecano viene mostrata durante la facilitazione degli impulsi accoppiati e la depressione del polso accoppiata. L'area normalizzata della membrana misurata in 30 punti temporali ha mostrato un'evoluzione simile in entrambe le condizioni del petrolio nonostante correnti diverse.

Il flusso normalizzato ha separato le variazioni della conduttanza indipendenti dall'area ed è stato coerente con cambiamenti nella conduzione della membrana oltre la semplice espansione dell'area. Una stimolazione prolungata con depressione del polso accoppiato per fino a 30 minuti ha prodotto un comportamento a lungo termine simile a una depressione nelle membrane esadecana, ma ha mantenuto un flusso elevato nelle membrane dodecano/esadecanano coerente con un comportamento a lungo termine simile a una potenziazione. Questo protocollo ci permette di misurare come la struttura della membrana e la conduzione ionica cambiano attraverso la ristrutturazione elettrica dei bilayer di interfaccia a gocce.

Questa piattaforma può supportare molti diversi protocolli di stimolazione in dibs con canali ionici, senza canali ionici e persino canali fotoisomerizzabili per sondare meglio la dinamica delle membrane e le proprietà elettriche. Poiché questa piattaforma sintonizzabile sonda sia la biofisica della membrana su scala macroscala che su scala microscala, i futuri esperimenti migliorerebbero notevolmente dall'uso della spettroscopia di fluorescenza per separare con maggiore sicurezza l'attività dei canali proteici dalla conduzione dei pori di membrana.